新型磁性纳米材料对胰蛋白酶的固定化

孙 俊，翁龙梅，刘 孟，胡坤雅

(江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江 212013)

固定化酶技术具有节省资源、降低污染，符合可持续发展的战略要求，受到了食品工业、生物技术、环境工程等领域学者们的青睐.胰蛋白酶作为一种动物来源的蛋白水解酶，能选择性地水解蛋白质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，在医药、食品工业等领域有着广泛的应用价值.然而游离的胰蛋白酶在水溶液中的稳定性极差，容易发生自消化反应，使酶催化反应难以控制，催化效率大大下降，因此，胰蛋白酶的固定化就备受关注［1-3］.然而传统的固定化载体依然存在固定化效率较低，酶稳定性较差，反应完成后回收工艺复杂等缺点，为此，寻找新型的固定化载体材料成为酶固定化领域的研究的热门方向.磁性载体材料是近年来发展起来的用于酶固定化的新型载体材料.与非磁性载体材料相比，经磁性材料固定化后的固定化酶容易从反应体系中分离、回收，并可以利用外部磁场控制固定酶的运动方式及方向，解决了传统的机械搅拌降低固定化酶活性的问题，进一步提高固定化酶的活性保留及催化效率［4-6］.基于其突出的应用优势，必将在日后酶固定化技术的应用中得到广泛关注.为此，本研究中以实验室现已制备所得的磁性纳米材料为酶固定化载体，探讨其对胰蛋白酶的固定化，并对固定化胰蛋白酶的构象变化、固定化条件及稳定性进行深入研究.

1 试验

1.1 材料与仪器

材料:TPCK-处理的胰蛋白酶，苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐(BAEE)，生工生物工程(上海)有限公司;牛血清白蛋白(BSA)，碳酸氢铵，浓盐酸，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，国药集团化学试剂有限公司，为分析纯;试验中所用水均为超纯水，电阻率为18.2 MΩ·cm.

试剂:THS-16数控超级恒温槽，宁波天恒仪器厂;AB104-N分析天平，FE20实验室pH计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;Nicolet Nexus傅立叶变换红外光谱仪，美国热电公司;UV-2450紫外分光光度计，日本岛津公司.

1.2 方法

1.2.1 磁性纳米颗粒的制备

课题组采用化学共沉淀法，制得了羧甲基壳聚糖(CM-CTS)修饰的、粒径在15 nm左右的磁性纳米颗粒，简写为Fe3O4(PEG+CM-CTS)，具体的合成方法参照文献［7］.

1.2.2 固定化胰蛋白酶的制备

准确称取10 mg Fe3O4(PEG+CM-CTS)纳米颗粒加入3 mL胰蛋白酶溶液，37℃恒温条件下缓慢振荡反应一定时间后，在外加磁场的作用下分离磁性颗粒，收集上清液，测定上清液中胰蛋白酶的含量.收集得到的磁性颗粒，用去离子水清洗数次，以完全去除未经吸附的游离胰蛋白酶，之后冷冻干燥，用于后续的理化指标及稳定性的研究.在280 nm下采用紫外分光光度法测定胰蛋白酶的固载量.制备所得的固定化胰蛋白酶简写为Fe3O4(PEG+CM-CTS)@Trypsin.

1.2.3 FTIR对固定化胰蛋白酶的表征

采用FTIR技术对固定化前后的胰蛋白酶的表面功能基团进行表征.采用KBr压片法进行制样:将待测冻干样品与KBr粉末以3∶100充分混匀，研磨，压片，之后进行4 000～400 cm-1的FTIR全波段红外扫描.

1.2.4 胰蛋白酶的活性测定

胰蛋白酶活性测定方法是在文献［8］的基础上略加改进.

1)胰蛋白酶活力单位定义:在25℃，pH=8.0条件下，每分钟能催化产生1 μmol BAEE产物的酶量，称为1个酶活单位.

2)溶液配制.BAEE底物溶液:用pH=8.0的25 mmol·L-1NH4HCO3缓冲溶液配制1 mmol·L-1的BAEE溶液，需现用现配.

待测酶液:待测的游离胰蛋白酶和固定化胰蛋白酶溶于25 mmol·L-1NH4HCO3缓冲溶液中(pH=8.0)，置于冰水浴条件下，避免胰蛋白酶自水解反应的发生.

3)测定方法:取2支试管，于第1支空白管中加2.8 mL底物溶液和0.2 mL，1 mmol·L-1HCl溶液，在紫外分光光度计中用1 cm吸收池在波长253 nm处进行调零;于第2支试样管中加底物溶液2.8 mL后，迅速加入0.2 mL待测酶液，立即混匀并开始记时.

然后在相同条件下测定，每隔半分钟读取一次吸光度A253，共读取4 min.以A对时间作图，取反应的最初线性部分，计算每分钟A253的增加值，然后按式(1)计算胰蛋白酶的活力(unit·mg-1)，即

式中:ρ(胰蛋白酶)为胰蛋白酶质量浓度，mg·mL-1;V(胰蛋白酶)为胰蛋白酶体积，mL;ΔA253为吸光度变化量，nm·min-1.

1.2.5 固定化胰蛋白酶的稳定性

1.2.5.1 固定化胰蛋白酶的重复利用

将10 mg BSA溶于2 mL NH4HCO3缓冲溶液(25 mmol·L-1，pH=8)中，95 ℃的水浴锅中处理15 min，在此变性的BSA溶液中加入5 mg固定化胰蛋白酶，37℃的恒温条件下反应15 min，反应结束后，在外加磁场的作用下回收固定化胰蛋白酶，然后用25 mmol·L-1NH4HCO3缓冲溶液(pH=8.0)清洗数次.重复使用同一批次的固定化胰蛋白酶重复上述步骤.在重复使用6次后，固定化胰蛋白酶的活性保留(相比于初始胰蛋白酶的活性)作为评估固定化胰蛋白酶重复利用性能的指标;固定化胰蛋白酶的活性保留表示为剩余活性与初始活性的百分比.

1.2.5.2 胰蛋白酶的储藏稳定性

室温25℃条件下，将5 mL，1.0 mg·mL-1游离胰蛋白酶溶液和10 mg·mL-1固定化胰蛋白酶分别保存在25 mmol·L-1NH4HCO3缓冲溶液(pH=8.0)中，每间隔一定时间取出等量酶溶液，测定胰蛋白酶活性.

2 结果与讨论

Fe3O4(PEG+CM-CTS)纳米颗粒作为胰蛋白酶的固定化载体具有以下优点:Fe3O4(PEG+CMCTS)纳米颗粒粒径较小且均一，赋予了胰蛋白酶较大的比表面积，可为胰蛋白酶的固定化提供更多的吸附位点;纳米颗粒和胰蛋白酶的等电点分别为5.1［7］和10.5，二者在很宽的pH条件下存在较强的静电作用，易于二者相互吸附;CM-CTS不仅赋予纳米颗粒载体良好的水分散特性，而且使其表面具有丰富的功能基团，可以直接与胰蛋白酶作用.

2.1 胰蛋白酶的FTIR表征

游离胰蛋白酶、固定化胰蛋白酶和 Fe3O4-(PEG+CM-CTS)纳米颗粒的红外光谱分析结果见图1.

图1 傅里叶红外光谱图

由图1可知:Fe3O4(PEG+CM-CTS)纳米颗粒的特征光谱条带中，既具有═FeO基团在584 cm-1的特征吸收峰，也有CM-CTS中的-NH2和-COOH基团分别在1 408 cm-1和1 588 cm-1的2个特征吸收峰(见Fe3O4(PEG+CM-CTS)纳米颗粒光谱曲线)，而固定化胰蛋白酶的红外光谱中不仅具有Fe3O4(PEG+CM-CTS)纳米颗粒的特征吸收峰，也有游离的胰蛋白酶(见游离胰蛋白酶光谱曲线)在 1 652 cm-1(-CONH，酰胺 I带)、1 266 cm-1(C—N，伸缩振动)和835 cm-1(N—H，不对称变形振动)的特征吸收峰.上述结果表明，胰蛋白酶已成功固定于Fe3O4(PEG+CM-CTS)纳米颗粒表面.

2.2 胰蛋白酶的固定化条件

2.2.1 缓冲溶液pH值的影响

在酶固定化研究中，缓冲溶液的pH值对酶的活性影响较大.主要是因为酶和固定化载体都存在于缓冲溶液中，而缓冲溶液pH值可以改变酶分子和固定化载体的表面离子化状态;此外，酶作为一种具有生物活性的蛋白质，当溶液的pH值超过一定范围时，微观结构会发生变化，酶构象的变化会引起酶活性的丧失.在不同pH值缓冲溶液中，对其固定化后胰蛋白酶的酶活及其载体对胰蛋白酶的固载量进行了研究(见图2).结果表明:pH=6.0条件下，所得固定化胰蛋白酶的相对活力和固载量qe相对较高，因此缓冲液pH值选择6.0.

图2 溶液pH值对Fe3O4(PEG+CM-CTS)纳米颗粒固定化胰蛋白酶固载量及其相对活性的影响

2.2.2 初始酶质量浓度的影响

图3为pH=6.0、质量为10 mg Fe3O4(PEG+CM-CTS)纳米颗粒和3 mL胰蛋白酶溶液，固定化温度为37℃，固定化时间60 min，胰蛋白酶初始质量浓度ce对固定化胰蛋白酶酶活和载体固载量qe的影响.

由图3可知:固定化胰蛋白酶的酶活和Fe3O4-(PEG+CM-CTS)纳米颗粒对胰蛋白酶的固载量，都随初始胰蛋白酶质量浓度的增大而提高;但当初始酶质量浓度大于1 mg·mL-1时，Fe3O4(PEG+CM-CTS)纳米颗粒对胰蛋白酶的固载量变化不显著，而此时固定化胰蛋白酶的活力开始呈现出下降趋势.这是因为Fe3O4(PEG+CM-CTS)纳米颗粒可固定的胰蛋白酶的酶量是有限的，当初始酶质量浓度较低时，随着酶液质量浓度增加，固定到磁性载体的酶量增加，活性也相应提高;但是酶液质量浓度过高，会造成酶分子相互聚集成团，导致酶分子的活性中心相互遮盖，致使酶活性降低;当初始酶液质量浓度为1 mg·mL-1时，固定化胰蛋白酶酶活最高可达到游离酶活的88.6%，此时，磁性载体对胰蛋白酶的固定化酶量接近饱和.因此，本试验固定化胰蛋白酶的最佳初始胰蛋白酶质量浓度为1 mg·mL-1.

图3 胰蛋白酶初始质量浓度的影响

2.2.3 固定化时间的影响

取一定量的Fe3O4(PEG+CM-CTS)纳米颗粒，浸于1 mg·mL-1，pH=6.0的胰蛋白酶缓冲溶液中，37℃恒温条件下，动态吸附一定时间，在预定的固定化时间条件下测定固定化胰蛋白酶的活力以及Fe3O4(PEG+CM-CTS)纳米颗粒对胰蛋白酶的固载量，结果如图4所示.

图4 吸附时间的影响

由于选用的Fe3O4(PEG+CM-CTS)纳米颗粒为超顺磁性纳米颗粒，具有较小粒径，较大比表面积，因此在吸附开始阶段吸附速率较快，经过30 min即基本达到吸附平衡;随着时间的继续延长，载体对胰蛋白酶的吸附容量变化很小，而酶活开始呈现出下降的趋势.这说明当固定化反应进行30 min时，胰蛋白酶的固定化反应基本完成，继续延长固定化反应时间，反而会造成胰蛋白酶的失活.因此，胰蛋白酶的固定化时间选择为30 min.超顺磁性Fe3O4-(PEG+CM-CTS)纳米颗粒对胰蛋白酶的最大吸附容量为102.4 mg·g-1，高于目前一些文献的报道［9-10］.

2.3 固定化胰蛋白酶稳定性分析

2.3.1 重复利用过程中的稳定性

固定化酶的重复使用次数和酶活保留率是评价固定化载体的重要指标，同时也将会在很大程度上决定固定化酶的应用前景.同一批次的固定化胰蛋白酶重复酶解BSA的结果见图5.

图5 重复利用对固定化胰蛋白酶的活性影响

由图5可知:固定化胰蛋白酶在重复酶解BSA的过程中，其相对活性逐渐下降，然而固定化胰蛋白酶在重复6次酶解BSA后，酶活还能保持在初始酶活的76.3%.表明固定化胰蛋白酶在持续的BSA水解中具有良好操作稳定性，原因可能为经固定化处理后，胰蛋白酶与固相载体之间的相互作用使胰蛋白酶稳定地结合于磁性纳米颗粒表面，阻止胰蛋白酶分子骨架和侧链的移动、胰蛋白酶分子间的相互作用以及多肽链的去折叠，进一步抑制了胰蛋白酶的自水解，使固定化胰蛋白酶抵抗失活的能力增强.此外，造成固定化胰蛋白酶在重复使用过程中活性损失的主要原因包括固定化胰蛋白酶在清洗过程中的少量损失、胰蛋白酶从载体上的泄露以及重复使用过程中胰蛋白酶的构象变化等.

2.3.2 储藏稳定性

通常情况下，处于溶液中的胰蛋白酶在长期储存中稳定性很差，活性也会降低.主要是因为游离胰蛋白酶在储存过程中酶的自水解作用所致，而胰蛋白酶经固定化后其构象稳定性增加，在一定程度上限制了自水解作用的发生，因此固定化胰蛋白酶的储存稳定性相应地提高.试验中，同一批次的固定化胰蛋白酶水解BSA后，在外加磁场的作用下收集固定化胰蛋白酶，用25 mmol·L-1NH4HCO3缓冲溶液(pH=8.0)清洗3次;然后分散于25 mmol·L-1NH4HCO3缓冲溶液(pH=8.0)，在室温下保存1周;之后采用相同的酶解BSA工艺对其酶解效率进行研究，并用MALDI-TOF MS再次进行鉴定，得到了与之前相同的BSA肽段数量，可见固定化胰蛋白酶在储存过程中保持了较高的稳定性和较好的活性保留.与此相反，游离胰蛋白酶储存2 d后基本已经完全没有了酶活，与文献［11］结论一致.综上可知:以Fe3O4(PEG+CM-CTS)纳米颗粒作为酶固定化载体，制备所得固定化胰蛋白酶可以用于蛋白质的快速酶解应用.

3 结论

1)FTIR技术表明胰蛋白酶通过静电相互作用固定于Fe3O4(PEG+CM-CTS)纳米颗粒表面;Fe3O4(PEG+CM-CTS)纳米颗粒对胰蛋白酶的吸附符合Langmuir等温吸附模型.

2)由于Fe3O4(PEG+CM-CTS)纳米颗粒载体具有较大的比表面积和良好的水分散特性，胰蛋白酶在载体表面的固定化在30 min内就达到了吸附平衡，速率较快.

3)固定化胰蛋白酶在持续的BSA水解过程中具有良好的操作稳定性，以及较高的储藏稳定性.

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