大气细颗粒物致C57小鼠急性肺损伤的试验

舒加乐， 邹亚娟， 孙新明, 金承钰

(上海交通大学 分析测试中心， 上海 200240)



大气细颗粒物致C57小鼠急性肺损伤的试验

舒加乐， 邹亚娟， 孙新明, 金承钰

(上海交通大学 分析测试中心， 上海 200240)

研究大气细颗粒物(PM)的急性毒效应对C57BL/6小鼠的肺及生理条件损伤的影响。用空气采样器采集大气中直径≤1.0 μm的悬浮颗粒物，以C57BL/6小鼠为试验对象，采用气管滴注的染毒方法，分空白对照组、生理盐水对照组和染毒组，于染毒前、后24 h取20 μL全血用于血细胞分析，24 h后取肺及肝脏组织做电感耦合等离子体发射光谱(ICP)元素分析。所收集PM1.0颗粒符合相关报道；染毒组血细胞分析自身对照发现染毒后有明显感染症状；组织器官中肺组织中硅元素含量变化具有临床观察意义。大气细颗粒物的吸入会引起小鼠的肺部炎症及机体的免疫反应，从而造成对肺组织相关元素含量的改变。

大气细颗粒物； 急性肺损伤； 血细胞分析； 电感耦合等离子体

0 引 言

PM1.0(Particulate Matter，PM)也称大气细粒子，指的是空气中空气动力学直径≤1.0 μm的悬浮颗粒物，其粒径小、比表面积大，易于富集空气中的有毒有害物质，并可以随着人的呼吸进入体内，甚至进入到肺泡和血液中，导致各种疾病，它还是能见度降低的罪魁祸首。颗粒物粒径大小不同,被吸入并沉积在呼吸系统的部位也就不同,对机体危害也有明显差异。

有研究表明，PM短期波动会影响心血管疾病的就诊率和入院率。Bell等[1]开展了美国202个城市 PM2.5变化与急诊就诊率关系的研究 ，发现 PM2.5浓度每增加 10 μg/m3，心血管疾病急诊就诊率增加0．8%(95%CI：0.59%～1.01%)。王宛怡等[2]报道，北京市大气PM10浓度每上升l0 μg/m3，当日心血管疾病门、急诊的就诊人次增加0．4%，滞后4 d的健康效应更明显，就诊率增加1．17%(95%CI：1.12%～1.21%)。基于对PM2.5健康危害的认识，细颗粒物目前已受到了全世界的普遍关注。美国EPA已经于1997年颁布了细颗粒物空气质量标准[3]，年均值为0.015 mg/m3,日均值为0.065 mg/m3，其限制非常严格。我国是颗粒物污染严重的国家，但细颗粒物的污染特征及对健康影响的研究目前仍处于起步阶段。以往的研究资料以总悬浮性颗粒物(TSP)和吸入性颗粒物(PMIO)为主，关于PM1.0对健康影响的动物试验资料还很缺乏。本试验就从血液生理影响和肺实质器官微量元素变化两方面探讨PM1.0对小鼠肺组织急性损伤的作用机理。

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器

(1) 试剂。元素标准为Sigma公司产品，其他均为国产分析纯，实验用水为双蒸水。

(2) 仪器。武汉天虹TH-150C型中流量采样器(流量100 L/min)，分别配置PM2.5和PM1.0的切割头、低温高速离心机、三分类血细胞分析仪(pocH-100iv diff，Sysmex，Japan)、电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP, Iris Advantage1000,ThermoJarrell ,USA)、激光动态光散射仪(PCS, Zetasizer Nano S, Malvern, UK)，扫描电子显微镜(SEM-EDS, Sirion200, FEI, USA-Oxford, UK)，冻干机(FreeZone®Stoppering Tray Dryers FreeZone®6, Liter，USA)。

1.2 PM1.0的采样和处理

(1) 样品的采集。采样滤膜为直径90 mm的玻璃纤维滤膜,选择交通大学闵行校区综合实验楼。采样时间上午8:00至次日上午8:00。采样器距地面约20 m。

(2) 样品的处理。颗粒物收集前后均在20℃称量滤膜，计算出每个滤膜上总颗粒物的质量。将载有颗粒物的滤膜裁剪为小块，浸入去离子蒸馏水中，超声振荡30 min×4次，洗脱颗粒物，震荡液经6层纱布过滤，滤液离心后收集下层悬液冷冻真空干燥，得到PM1.0在-20℃保存，染毒时，用0.9%生理盐水配制成需要的浓度，使用前超声振荡15 min混匀。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物分组方法

选择雄性C57BL/6品系小鼠[4]，由中国科学院提供，体重23～29 g,共12只。所有的小鼠均饲养在SPF级动物房中，依照体重，将C57BL/6品系小鼠随机分成3组，每组4只，分别是空白组、生理盐水对照、PM1.0染毒组。

1.3.2 染毒的方法

计算出冻干的PM颗粒粉末受毒剂量14 mg/kg，用生理盐水配制成7 mg/mL浓度的受毒液，采用气管滴注的方式染毒，气管滴注量按照2 mL/kg BW单次染毒。

1.3.3 样品采集

(1) 全血采集。在染毒前后的24 h，小鼠尾静脉采血20 μL于EDTA-K2抗凝管中。30 min内做血细胞分析。

(2) 组织脏器采集。小鼠染毒24 h后处死，采集肺脏及肝脏，用滤纸吸干称量后铝箔纸包裹4℃保存并送样。

1.4 样品处理

1.4.1 大气细颗粒物(PM1.0)性状分析

采用DLS表征测试手段分析染毒液体中PM颗粒的分布情况，SEM观察PM颗粒的分散性以及尺度。

1.4.2 三分类全血细胞仪血液常规值分析

1.4.3 ICP-MS元素分析

直接取新鲜肺脏及肝脏组织放置于聚四氟乙烯消解罐中，加5 mL浓硝酸，次日加1 mL 30%H2O2，随后微波消解，使用2%硝酸定容至10.0 mL之后用于ICP分析。

测试组织中8种微量元素Ca、Cu、Fe、Mg、Mg、Se、Si、Zn在脏器组织中的含量变化。

2 结 果

2.1 PM1.0颗粒表征

采用PCS、SEM等表征PM1.0颗粒的形态、原始尺度以及溶液中分散形态。由图1(a)可见，染毒液中PM颗粒分布主要以两种平均粒径为主(φ≈0.1～0.8 μm)，均小于1 μm。图1(b)为不同放大倍率的SEM扫描图，由图可见,此次收集的大气细颗粒物多为圆形颗粒物，粒径约1 μm，但存在部分聚集颗粒。由PCS和SEM结果可以认为染毒液中的颗粒尺度符合PM1.0的描述标准。

2.2 C57BL/6小鼠血液学数值测定结果

血液常规值测定结果如表1所示，14个测定项目，血液学数值染毒前后自身比对。空白对照组平均血红蛋白浓度(MCHC)上升、粒细胞总数(W-LCC)下降，差异达到显著水平P<0.05；生理盐水对照组白细胞(WBC)上升、血红蛋白(HGB)下降、血细胞压积(HCT)下降、血小板(PLT)下降、淋巴细胞总数(W-SCC)上升、粒细胞总数(W-LCC)上升，差异达到显著水平P<0.05；染毒组白细胞(WBC)下降、血红蛋白(HGB)下降、中间细胞百分数(W-MCR)下降、淋巴细胞总数(W-SCC)上升，差异达到显著水平P<0.05，血小板(PLT)下降，差异达到极显著水平P<0.01。

(a) PCS对PM1.0颗粒粒径的表征

(b) SEM对PM1.0颗粒形态的表征

图1 PM1.0颗粒表征

2.3 肺组织中元素含量对照

8种微量元素在肺组织中含量的变化结果见表2。① 生理盐水对照组与空白对照组相比较硅元素变化差异显著P<0.05。② 染毒组与空白对照组相比较钙、镁元素变化差异显著P<0.05；硅元素差异变化极显著P<0.01。

2.4 肝脏组织中元素含量对照

8种微量元素在肺组织中含量的变化结果见表3。① 生理盐水对照组与空白对照组相比较元素变化无明显差异P﹥0.05。② 染毒组与空白对照组比较，镁元素差异变化显著P<0.05。

表1 C57BL/6小鼠染毒后24 h血液学数值测定结果

注：自身比较，*P<0.05，**P<0.01，↑均值上升，↓均值下降

表2 肺组织中元素含量分析 mg/L

注：组间比较，*P<0.05，**P<0.01

表3 肝脏组织中元素含量分析 mg/L

注：组间比较，*P<0.05，**P<0.01

3 讨 论

急性肺损伤(Acute Lung Injury，ALI)是指由心源性以外的各种肺内、外致病因素导致的急性、进行性呼吸衰竭。引起急性肺损伤的原因或高危因素很多，可以分为肺内因素(直接因素)和肺外因素(间接因素)。炎症反应、肺组织损伤和纤维化是急性肺损伤主要的发病机制和病理改变。小鼠的血液生理正常指标会随着种群、性别、周龄、饲养环境等一系列的环境因素改变而改变[5-7]。所以本次试验以小鼠血液生理指标观察肺损伤后的炎症反应，并以小鼠自身试验前后的指标相比较，来探讨实验结果。Sorensen[8]以人群为研究对象发现, 个体PM2.5的接触量与血中血小板数和纤维蛋白原浓度无关, 与红细胞、血红蛋白浓度仅在女性中发现有明显关系( PM2.5每上升10 μg/ m3红细胞数上升2.3%,P<0.01; 血红蛋白浓度上升2.6%,P<0.01) 。Donaldson[9]认为红细胞数上升可使血黏度增加, 而血黏度增加是导致心血管疾病的危险因素。本次试验为急性毒性试验，所以空白组对照组平均血红蛋白量(MCH)、粒细胞总数(W-LCC)差异虽然达到显著水平(P<0.05),但是没有比较学意义。生理盐水对照和染毒组中白细胞(WBC)、血红蛋白(HGB)、血小板(PLT)、淋巴细胞总数(W-SCC)都有差异性变化且总趋势表现为炎性感染的淋巴细胞增多，而染毒组中血小板(PLT)下降差异达到极显著水平(P<0.01)。这些血液指标的差异可以有限地反映出急性炎症感染情况。所以从本试验看，不管是生理盐水还是PM液体给动物鼻腔受毒，都会引起动物的炎性反应，而PM颗粒受毒时，炎性症状会更明显，即PM颗粒溶液对动物机体的危害性更大。

有关人体脏器组织中微量元素的含量国内外已有大量的文献报道，而对于动物尤其是实验动物的相关报道却很少。测定实验动物微量元素的含量对医学研究中建立实验动物模型及探讨微量元素在生理和病理过程中的作用有着重要的意义。几乎所有的必需矿物元素，无论是常量还是微量元素，在细胞体内都具有一种或多种催化功能。Clarke 等[10]给狗吸入浓集的大气细颗粒物( Concentrated Ambient Particles, CAPs) 发现, 当采用混合线性回归统计后, 颗粒物的具体组分与狗的生物学反应密切相关。如CAPs 中的硫酸盐浓度与外周血白细胞计数增加相关, 炭黑、铝、锰、硅、锌等元素与血液中多形核白细胞数目增加有关, 钠元素可以引起血液淋巴细胞数目的增加, 而铝、锰、硅则可减少淋巴细胞的数量等。采用因素分值法分析后还发现, 支气管肺泡灌洗液( Bronchoalveolar Lavage, BAL) 中性粒细胞百分比和外周血白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞数目的增加与铝、硅元素密切相关; BAL 中巨噬细胞和血液中性粒细胞数量的增加与钒、镍元素有关; 血液红细胞计数、血红蛋白水平的明显下降与硫元素有关。这些数据都提示了细颗粒物的吸入有可能使健康机体的肺功能和血液系统产生微妙的变化, 而血液细胞数量与组成的变化有可能是造成日后心血管病变的一个潜在隐患。本次试验根据相关文献[10-14]选出8种微量元素，测试其在实验动物器官(肺及肝脏)中的元素含量变化。发现在肺组织中硅的元素变化差异极显著(P<0.01)。这与Batalha 等[ 15]的研究结果相吻合。Batalha 等发现短期接触浓集的细颗粒物( CAPs) , 健康的SD 大鼠和患慢性支气管炎( CB) 的SD 大鼠的肺小动脉都会发生收缩( 测血管的L/W比值, 即血管腔直径与血管壁厚度之比) , 而该效应与CAPs 的浓度和它的组成颗粒(硅、硫酸盐、铅、元素碳及有机碳等)的成分浓度有关。之所以产生这些变化，分析其可能的原因，其中比较合理的解释是因为硅颗粒表面的氧自由基可导致活性氧生成增加及前炎症因子产生, 因此认为可能是氧自由基在起作用[16-17]。本次试验在肝脏组织中发现含量变化显著的镁元素在急性毒性实验中作为数据参考值，就不做比较学讨论。

4 结 语

关于PM1.0对机体的损伤机制是一个及其复杂过程，本次试验只是初步探讨了血液生理指标和组织脏器微量元素含量改变在PM1.0急性肺损伤中的作用，从实验中我们得到了动物免疫力下降并伴有炎症感染的结果，也发现了染毒后肺组织脏器中硅元素含量的明显变化。对于PM1.0对健康影响的其他途径，以及各途径之间的共同作用和相互联系，乃至作用之后具体的调节方式，都需要今后更加深入并完善我们的试验研究方案。我们期待设计更加合理的流行病学和生物学研究方向，为PM引起的疾病防治提供更加充实的证据，服务于我国大气污染的控制和公众健康水平的提高。

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Acute Pulmonary Injury Induced by Atmospheric Particulate Matter in C57Mice

SHUJia-le,ZOUYa-juan,SUNXin-ming,JINCheng-yu

(Instrumental Analysis Center, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240, China)

The study is to explore the acute pulmonary toxicity effects on C57BL/6 mice of atmospheric fine particulate matter (PM) and conditions of physiological injury. PM1.0was collected by dust sampling, C57BL/6 mice were considered as test subjects. By using intratracheal instillation exposure method, these mice were divided into three groups: sub-control group, saline control group and the treated groups. 20 μL whole blood was taken prior to exposure and 24 hours after exposure for blood cell analysis, and lung and liver tissues were examined by ICP for elemental analysis. PM1.0particles collected in line with the relevant reports; obvious symptoms of infection were found in exposed groups via self-control analysis of blood cells after exposure; changes in lung tissue and organ tissue of silicon content had clinical significance. Inhaled airborne fine particulate matter could cause the immune response, result in changes in the lung tissue of mice relevant element contents.

particulate matter(PM); acute lung injury; blood cell analysis; inductively coupled plasma(ICP)

2014-08-01

舒加乐(1979-)，男，上海人，硕士生，研究方向：实验动物生理、病理。Tel.：021-34207514-104；E-mail：salenshu@sjtu.edu.cn

金承钰(1974-)，女，江苏常州人，博士，副研究员，研究方向：纳米颗粒安全生物安全性评价。

Tel.：13916696268；E-mail：cyjin@sjtu.edu.cn

Q 954

A

1006-7167(2015)03-0058-05