关节软骨退行性变基因治疗研究进展*

邓尚 陈竹综述 冯刚 审校

(1.四川医科大学附属医院骨科，四川 泸州 646000; 2. 南充市中心医院·川北医学院第二临床医学院组织工程与干细胞研究所， 四川 南充 637000)

关节软骨退行性变基因治疗研究进展*

邓尚1,2陈竹2综述 冯刚2审校

(1.四川医科大学附属医院骨科，四川 泸州 646000; 2. 南充市中心医院·川北医学院第二临床医学院组织工程与干细胞研究所， 四川 南充 637000)

关节软骨退行性变是临床的常见病和多发病，缺损后依靠自身修复的能力很低。基因治疗为软骨退行性变的缺损修复提供了新的方向，基因转染技术能使靶细胞大量表达软骨生长调控因子，有效地促进软骨生长和基质合成，达到修复软骨的目的。本文就基因治疗技术中的目的基因、基因运载体及其在软骨退变缺损区作用的研究进展进行综述。

关节软骨退行性变; 基因治疗; 目的基因; 载体

关节软骨退行性变属于骨科的常见多发病。由于正常的关节软骨没有血管及神经的支持，软骨细胞增殖能力低，营养支持主要依靠滑膜的弥散机制，损伤后难以自行修复，因此即使比较小的软骨损伤也可能产生比较显著的症状如进行性疼痛 、肿胀、功能障碍，最终发生关节的退行性变，导致骨关节炎的发生[1]。软骨修复是一个极其复杂的过程，目前有许多方法应用于软骨修复[2]，主要分为手术治疗以及保守治疗，前者包括软骨下骨钻孔术、镜下清理和微骨折术、骨软骨移植术、骨膜软骨膜移植术等，后者包括口服药物和局部注射。其效果主要暂时缓解疼痛，但关节软骨的生物学性能不能完全恢复，且存在与手术、治疗费用、长期预后等有关的问题[3]。随着生物医学工程的发展，基因治疗技术逐渐引起人们重视，且重组基因成功转导至软骨细胞治疗软骨退变已应用于临床实验中[4]。其基本原理是将目的基因修饰相关细胞，使其表达某些具有治疗作用的基因产物，促进缺损处软骨细胞的修复和增殖分化，并且可以在软骨再生过程中持续、高效地分泌生长因子，完成修复过程。转导的方式包括体内途径和体外途径两种方式[5]。本文就与软骨退变损伤修复有关的生长因子基因、载体等相关问题展开综述。

1 目的基因的选择

软骨细胞与软骨退变缺损有着相似的演变过程，而大量研究证实生长因子在自分泌和旁分泌机制的下通过信号或信使系统，作用于靶细胞受体，影响软骨细胞的增殖、分化和基质代谢活动，从而促进软骨缺损的修复[6，7]。而这些调控生长因子的基因，结构和作用机制不尽相同。

1.1 转化生长因子-β(Transforming growth factor beta,TGF-β)基因 TGF-β是分子量25kDa，由二硫键链接的二聚体蛋白。通过TGF-β受体及其细胞内信号系统将信号传递到细胞核内而起到多种不同的生理调节作用[8]。TGF-β超家族常用于诱导间充质干细胞分化为软骨,也是体外诱导骨髓间充质干细胞转化成软骨方向的关键生长因子，在没有加入TGF-β的定向培养基中骨髓间充质干细胞未能向软骨方向转化[9]。TGF-β能够促进软骨分化、增殖，并且阻止软骨细胞的肥大，并能抑制软骨胶原酶的表达[10]。Cheng Man等人[11]将转染TGF-β基因到兔的右侧下颌关节缺损处，左侧注射生理盐水对照，24周时实验组可见一层结构良好的纤维软骨覆盖缺损表面。RT-PCR检测发现转染后12、24周实验组合成代谢基因、蛋白聚糖、II型胶原蛋白表达较对照组明显增加，但两组的分解代谢基因表达无明显差别。说明TGF-β主要作用是通过促进合成代谢因子的表达上调促使软骨的修复，而对IL-1和蛋白聚糖酶等分解代谢因子的抑制作用并不明显。Tchetina等[12]用TGF-β2、FGF-2和胰岛素转导至关节炎患者的膝关节软骨培养，发现胶原酶降解作用明显下调，而FGF-2和胰岛素单独使用不能抑制胶原蛋白的分解，TGF-β2却能在低浓度下可抑制胶原的分解，且促使上调因子PGE2的表达增强，可见TGF具有选择性抑制分解代谢的因子的作用，TGF-β2能作为II型胶原降解的治疗手段之一，但是TGF诱导软骨的安全性以及残存的免疫原性等问题有待进一步的研究与证实。

1.2 骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP)系列基因 BMP是一组分泌性、疏水性、酸性的糖蛋白，能诱导成骨细胞和软骨细胞的分化成熟，在维持关节软骨的形成以及软骨缺损后的修复起着重要作用，其中起主要诱导作用的是骨形态发生蛋白2，4，7。Chubinskya[13]通过比较BMP-2、BMP-4、BMP-6和BMP-7及CDMP-1、CDMP-2等因子在人正常关节软骨细胞中的作用后,发现BMP家族刺激蛋白聚糖增殖的能力均比其他因子强，其中BMP-7作用最强，且具有抗白细胞介素1β分解蛋白聚糖的能力。Kakudo等[14]发现，BMP-2可诱导未分化的间充质干细胞分化为软骨细胞或者成骨细胞，提高细胞内骨钙蛋白、碱性磷酸酶、II型胶原mRNA的表达，并且通过表达VEGF，为骨组织内的血管形成创造良好的生长环境。虽然BMP表现出较强的骨诱导活性，但是BMP进入体内后易随体液流失降解，半衰期短，且BMP具有强大的调控未分化间充质细胞向成骨细胞转化的功用，在临床应用中使用BMP高剂量会提高关节肿胀、血肿及癌症的风险[15]。因此如何提高BMP在细胞中的作用持续时间、调控定向分化的能力，且选择合适的治疗剂量，将是一个值得继续研究的方向。

1.3 胰岛素样生长因子( Insulin-like Growth Factor,IGF)基因 IGF-1和IGF-3是成骨细胞分化的正调节因子，可促进多种骨诱导因子分泌，促进骨钙素分泌和骨结节的形成，主要在骨的矿物化过程中发挥重要作用。IGF-1是由70个基酸残基组成的多肽，编码IGF-1的基因位于16号染色体。Henning Madry等人[16]将lacZ和IGF-1基因分别转染至软骨细胞培养，体外培养后IGF-1转染组细胞重量明显较lacZ组多。再将培养的细胞经聚乙醇酸支架转导至兔软骨缺损处。HE染色可见IGF-1组软骨细胞比lacZ组多50%左右。免疫染色和免疫荧光检测到II型胶原蛋白IGF-1组的表达强度为lacZ组的1.6倍。该实验证明IGF-1基因的调控促进了软骨的修复。

1.4 生长分化因子-5(growth differentiation factor-5,GDF-5)基因 GDF-5属TGF-β超家族中的GDF亚家族，也称BMP-14。GDF-5在软骨发育初期主要是促进间充质和前软骨细胞在特定部位的聚集，在后期则促进软骨细胞的分化、肥大。刘康[17]等人采用携带GDF-5的腺病毒诱导分化骨髓间充质干细胞,被感染的BMSCs细胞外基质糖胺聚糖和蛋白聚糖的含量显著增加,软骨细胞具有特异性的Aggrecan和CollagenⅡ基因蛋白表达升高，说明了GDF-5能明显促进骨髓间充质细胞向软骨细胞分化。Wulsten D[18]研究发现，GDF-5比BMP-2有更强的促软骨分化能力，但是成骨分化能力较BMP-2弱。Coleman M[19]等人应用GDF-5加入人骨髓间充质细胞培养，发现其促软骨分化能力与剂量呈依赖效应，当剂量100ng/ml时软骨分化能力最强。同时发现GDF-5能促进SMADs 1-5-8的磷酸化作用，而SMADs 1-5-8细胞内的信号分子通路能促进后期的软骨细胞肥大和矿化。此外，李战梅等[20]在促脂肪干细胞向软骨细胞分化实验中发现，100ng/ml的GDF-5浓度比常用的10ng/mlTGF-I的促分化作用更强。

2 载体的选择

基因载体是指能将外源基因导入靶细胞，并使其在靶细胞内表达的病毒或DNA结构。目前载体被分为病毒载体和非病毒载体两大类[21]，病毒载体(viral vectors)病毒载体相比非病毒载体转染率高、持续时间长的优点，但是有插入突变及病毒感染的危险，且重组体进入宿主基因组产生激活不良肿瘤基因的可能性，影响基因治疗效果[22]。

2.1 腺相关病毒 (Adeno-associatedvirus, AAV) AAV是一种非致病原，有较低的免疫源性，现已有多种AAV血清型，其不仅提高装载率，同时能中和体液免疫反应产生的抗体。AAV已被广泛应用于软骨细胞基因治疗的研究。Gang Feng等人[23]采用腺病毒介导的GDF-5转入脂肪干细胞培养，发现Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达增加，细胞外基质增多，证实了脂肪干细胞具有向软骨细胞转化的潜能。Kang等[24]通过腺病毒将 BMP-7转入脂肪干细胞培养，有效转染率高达99%，再将转染后的脂肪干细胞植入大鼠体内，并于3周后即形成新生骨。腺病毒感染细胞后，初期可获得高效表达，但由于病毒DNA并不整合到宿主基因染色体上，随着时间的增长，表达量会逐渐下降，其编码的病毒蛋白有诱导免疫反应的可能，并且重组过程复杂，限制了其在基因治疗中的应用。

2.2 慢病毒载体 (Lentiviral vector，LV) 多数慢病毒载体是基于I型人免疫缺陷病毒(HIV)基因改造产生的，其最大的特点是可以感染非分裂期细胞，如神经细胞、造血干细胞、肝细胞等，整合到宿主基因组，实现基因稳定长效表达，感染效率高，容纳外源性目的基因的片段大，免疫原性小，生物安全性好。Yongchang Yao等人[25]通过慢病毒载体携带TGF-β3基因联合胶原蛋白-I的沉默基因shRNA，成功促进对猪的软骨细胞再分化的三维培养，该结果说明慢病毒载体可携带基因通过转基因技术治疗关节软骨的退变。慢病毒还具有操作简便等优点，使其成为体内、外基因转移的一种有效工具，但有引起插入突变的风险,且该病毒的特殊来源亦是潜在危险因素之一。

2.3 非病毒载体(Non-viral vectors) 非病毒基因载体转移包括显微注射法、电穿孔法、微粒轰击法(基因枪)、脂质体法或者使用未结合的裸DNA法等。改良阳离子脂质体和FuGene6是两种已被用于软骨修复重建的基因传递的两种载体，非病毒载体不会出现重组体复制出活性病毒而引起其他疾病的可能，重复使用不会引起免疫反应或者仅有较弱的反应，制作较病毒载体容易[26]。但是非病毒类载体的转染效率常较病毒类载体低，转染后以游离形式存在于目的细胞中，基因持续表达时间较短，一定程度上限制了其应用。

2.4 微球载体 (Microspheres Vectors) 近年来可生物降解的微球载体因为其治疗药物的靶向运输传导，且对人体更弱的毒副作用受到组织工程的极大关注[27]。通过酸的冷冻干燥制得多孔壳聚糖微球以其特有的聚阳离子性、安全无毒和多功能性，应用于各个领域[28]。其在软骨退变缺损修复的实验研究中也广泛使用，Sukarto A等[29]人利用壳聚糖复合水凝胶微球材料装载BMP-6、TGF-β3和人脂肪干细胞在软骨基础培养基中培育，发现微球装载生长因子联合培养脂肪干细胞的分化软骨细胞的能力明显强于直接加生长因子于培养基中的脂肪干细胞的分化能力。Zhao J等人[30]将壳聚糖纳米微球结合针对沉默MMP-3和-13DNA的shRNA，再将微球-质粒结合体转染至软骨细胞中，观察MMP-3和-13促进软骨细胞的去分化影响得到明显抑制，软骨细胞的生长能力进一步增强。

3 小结与展望

目前关节软骨退变缺损的基因治疗无论在实验和临床阶段，修复组织的质量与稳定性比原生的软骨组织的仍有差距。关节软骨损伤修复的影响因素众多，就生长因子来说，往往是多种因子共同作用而不是单一因子单独作用导致病变的发生。多基因联合转导以及根据不同目的去调控基因的表达时间和量是将来基因治疗的发展方向，未来的挑战将是根据修复的具体的方面选择最合适高效的组合[31]。随着对基因转移系统的深入研究，更高的安全性及高效率的转染表达的载体将会提高基因的治疗效果。就现有成果来看，基因治疗对于关节软骨退变缺损修复具有一定的可行性。随着对关节软骨病理生理研究的逐步深入，治疗基因、基因递送系统和载体以及转染调控的进一步发展完善。虽然基因治疗短期内不能用于临床，但是对于治疗因子长期转染作用于缺损处的治疗将会有着重大的突破和光明的前景[32]，为临床的治疗提供一个更加令人满意的未来。

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职称晋升对医学论文“论著”的认定标准介绍

参照四川省卫生和计划生育委员会川卫办发[2015]104号文件中关于“卫生专业技术人员申报高级专业技术职务任职资格……”的通知精神及国家标准对科技学术论文的要求，现就医学论文“论著”的认定标准介绍于下：

1 “论著”是医学论文体裁中常见的一种表现形式(以下简称医学“论著”)，具有特定的概念，它是作者将自己在科研、临床、教学中的科学发现和技术创新的成果、经验、体会，以严密的逻辑论证、规范形成的文字作品，是医学论文中最具典型性和代表性的文体。

2 医学“论著”应具有四大特点：①在写作的格式上有比较规范的要求，包括：中英文文题、作者姓名(拼音)、作者单位、属地、邮编，符合文题内容要求的结构式摘要(包括：目的、方法、结果、结论四项)、关键词(3～8个)；正文包括前言(引言)、资料(材料、实验、对象)与方法、结果、讨论和结论及参考文献(本刊要求15条以上)等各项内容；“论著”字数应在4000字以上(含表、图所占的版面相应字数，本刊要求6000字以上)。②医学“论著”是作者从自己已占有的基本素材(第一性资料)出发，经过科学、严谨地整理、加工、分析、论证，得出论点并形成规范性的文字作品。③医学“论著”所表达的结论比较明确、可信，论文质量与学术价值较高。④医学“论著”应为一次性文献(含循证医学的系统评价)。

3 医学“论著”的认定：论文的文体结构具备“论著”所要求的各项规范内容及特点，同时刊载于公开发行的合法主流期刊(非增刊、内刊或学术会议的论文集)上，不论刊载期刊是否设置“论著”栏，均认定该论文体裁属“论著”。如果该论文不具备“论著”所要求的各项规范内容及特点，即使该论文被编排于“合法”刊物的“论著”栏目内，也不能认定该论文属“论著”。

《西部医学》2007年第6期1218～1221页上刊发有一篇专论：《关于医学论文的“论著”界定原则与晋升职称申报中对“论著”要求的探讨》及《西部医学》“读者·作者·编者”栏目和网站www.xbyxqk.cn等对“论著”撰写格式与基本项目的要求等介绍均极具学习、借鉴价值，特推荐读者、作者参阅。

(本刊编辑部)

Research progress of gene therapy on articular cartilage degeneration

DENG Shang1,2,CHEN Zhu2reviewingFENG Gang2cheking

(1.TheAffiliatedHospitalofSichuanMedicalUniversity,Luzhou646000,Sichuan,China; 2.InstituteofTissueEngineeringandStemCells,NanchongCentralHospitalandTheSecondClinicalInstituteofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,Sichuan,China)

Articular cartilage degeneration is a common disease, but self repair capacity is very low. Gene therapy provides a new direction for repairing cartilage degeneration, gene transfection technology can make the target cell expression of cartilage growth regulating factor, effectively promote the growth and repair of cartilage matrix synthesis of cartilage to achieve the purpose. In this paper, The aim of this review is to summarize the target gene, gene vector and the appropriate role in the degeneration of cartilage defect areas in gene therapy.Currently cartilage degeneration gene therapy is still in the experimental stage. To repair cartilage gene transfection technology promotes target cells to express cartilage growth regulatory factor and results in cartilage growth and matrix synthesis. Gene therapy provides a new method for the cartilage defect repairment.

Articular cartilage degeneration; Gene therapy; Target gene; Carrier

国家自然科学基金项目(81201407，81171472)

冯刚，教授，《西部医学》副主编，E-mail:fenggangncch@gmail.com

R 684.3

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2015.06.052

2014-05-22； 编辑： 张文秀)