EB病毒急性感染的实验室血清学诊断方法研究

龙 彦，刘 畅，孙媛媛，赵晓涛，王 辉



·短篇论著·

EB病毒急性感染的实验室血清学诊断方法研究

龙 彦，刘 畅，孙媛媛，赵晓涛，王 辉

目的 对化学发光免疫分析法(CLIA)测定EB病毒衣壳抗原IgM(EBV-VCA IgM)的结果进行方法学评价，并与酶联荧光分析法(ELFA)、酶联免疫吸附试验法(ELISA)诊断EB病毒(EBV)急性感染的效能进行比较。方法 选取2011年5月—2012年10月北京大学人民医院不明原因发热患者142例，对受试者使用分离胶真空采血管抽取静脉血3 ml，分离血清，采用CLIA、ELFA和ELISA检测EBV-VCA IgM，比较3种方法诊断EBV急性感染的价值；并对CLIA进行方法学评价。结果 CLIA低、中和高值(分别为25.8、81.8、184.4 U/ml)血清标本批内变异系数(CV)分别为5.7%、3.9%和2.6%，批间CV分别为11.4%、5.4%和4.2%。理论值与实测值间的回归方程为Y=0.090 4+1.005 2X，相关系数r=0.998(P<0.001)，回收率为95.3%～104.8%；当标本中血红蛋白水平达8 g/L，三酰甘油达30 000 mg/L时，均不干扰CLIA。CLIA诊断EBV急性感染的灵敏度为94.2%，特异度为91.1%，Youden′s指数为0.853；ELFA诊断EBV急性感染的灵敏度为82.7%，特异度为88.9%，Youden′s指数为0.716，；ELISA诊断EBV急性感染的灵敏度为80.8%，特异度为91.1%，Youden′s指数为0.719。CLIA诊断EBV急性感染ROC曲线下面积(AUC)为0.962〔SE=0.021，95%CI(0.920，1.004)〕；ELFA诊断EBV急性感染的AUC为0.960〔SE=0.015，95%CI(0.911，0.990)〕；ELISA诊断EBV急性感染的AUC为0.882〔SE=0.031，95%CI(0.823，0.942)〕。ROC曲线显示，CLIA诊断EBV急性感染的最佳诊断界值为41 U/ml，灵敏度为96.2%，特异度为99.7%，Youden′s指数为0.959。结论 CLIA是目前测定EBV-VCA IgM较灵敏的定量检测方法，优于ELFA和ELISA，适用于临床EBV感染的早期诊断。

爱泼斯坦巴尔病毒感染；发光测定法；酶联免疫吸附测定；酶联荧光分析法

龙彦，刘畅，孙媛媛，等.EB病毒急性感染的实验室血清学诊断方法研究[J].中国全科医学，2015，18(5)：582-584，587.[www.chinagp.net]

Long Y，Liu C，Sun YY，et al.Research of laboratory serological diagnostic method for acute EB virus infection[J].Chinese General Practice，2015，18(5)：582-584，587.

EB病毒(EBV)属疱疹类病毒之一，人类对EBV普遍易感，成人EBV感染率高达90%[1]，人体感染EBV后病情轻重不一，多数患者症状轻微，但严重时可累及全身各脏器系统，甚至出现严重并发症而危及生命[2]，因此，及时、准确地诊断EBV急性感染至关重要。EBV衣壳抗原IgM抗体(EBV-VCA IgM)在EBV感染急性期出现，可持续1～2个月，对诊断EBV急性感染意义重大[1]。酶联免疫吸附试验(ELISA)法是目前实验室用于EBV-VCA IgM检测较为广泛的方法，但ELISA法受不同试剂厂商、实验室条件、操作人员影响较大，多手工操作，且只能进行定性或半定量检测，灵敏度有待提高，在一定程度上给临床早期诊断、监测病情带来一定困难[2]。酶联荧光分析法(ELFA)在一定程度上提高了EBV-VCA IgM检出的灵敏度[3]，但成本较高。本研究对化学发光免疫分析法(CLIA)用于EBV-VCA IgM定量检测价值行方法学评价，并与ELFA、ELISA法相比，进一步验证CLIA检测EBV-VCA IgM临床应用的有效性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2011年5月—2012年10月北京大学人民医院不明原因发热患者142例，其中男69例，女73例；年龄3～67岁。EBV急性感染的诊断金标准为同时出现发热、咽峡炎、淋巴结及肝脾大，外周血淋巴细胞数增多，异常淋巴细胞占淋巴细胞总数10%以上或血清嗜异性凝集反应阳性[4]。对受试者使用分离胶真空采血管抽取静脉血3 ml，避免饱餐后采血，以3 000 r/min在离心机中离心3 min，离心半径为10 cm，分离血清，48 h内完成检测者置于4 ℃保存备用，否则置于-20 ℃保存备用。

1.2 主要仪器及试剂 CLIA采用Liaison全自动CLIA仪(意大利，Diasorin公司)，全封闭配套试剂包括包被有EBV衣壳抗原(p18多肽)的磁性微粒、结合异鲁米诺衍生物的鼠抗人IgM抗体、高值和低值定标液、激发液和缓冲液；ELFA为美国生物梅里埃公司提供的Vidas操作系统及其配套试剂(包被抗原VCA的多肽片段p18多肽)；ELISA法测定EBV-VCA IgM的试剂盒为欧蒙(德国)医学实验诊断股份有限公司产品。

1.3 检测方法 CLIA测定：测定原理是在磁性微粒表面包被有p18多肽，如果待测血清中含有EBV-VCA IgM，则可与之结合，然后加入异鲁米诺衍生物的鼠抗人IgM的结合物，孵育后洗去未与固相载体结合物。加入激发液启动发光反应，光信号强度与EBV-VCA IgM的浓度成正比。标本测定在Liaison全自动CLIA仪上完成，以>40 U/ml为阳性。每次检测前进行光路校正和质控。

ELFA测定：试剂盒SPR管内包被有捕获IgM的抗IgM抗体，通过液体培养基内稳定的抗原(VCA-p18)检测IgM的存在，经第1次孵育后洗去多余的抗体，再次加入针对稳定抗原的经底物4-甲基伞形的磷酸盐(4MU)标记的抗体，底物经碱性磷酸酶水解作用后形成4-甲基伞形酮，伞形酮荧光在370 nm激发，在450 nm测定，测定的荧光强度与标本中的抗体浓度成正比。标本测定在Vidas全自动CLIA仪上完成，TV>0.19为阳性。每次标本测定前均进行定标和质控。

ELISA法测定：双抗夹心法，操作严格按照试剂盒说明书进行。每次检测在加样同时加入定标液和阴、阳性对照。结果以标本的吸光度与定标液吸光度比值(S/CO)≥1.0为阳性，<1.0为阴性。

1.4 CLIA方法学评价 精密度测试：取低、中、高值血清(分别为25.8、81.8、184.4 U/ml)，分别重复测定20次，计算变异系数(CV)，反映批内精密度；各水平的混合血清测定2次/d，连续10 d，共20次，评价批间精密度。

准确度测试：采用Liaison EBV-VCA IgM检测试剂配套的稀释液，将中、高值混合血清经1∶2至1∶32稀释后做CLIA测定，计算回收率，并进行实测值和理论值间的线性回归分析。

干扰试验：取中值血清分别加入定量的血红蛋白、三酰甘油，测定EBV-VCA IgM浓度。

1.5 统计学方法 采用SPSS 13.0软件包进行统计学分析，绘制ROC曲线并计算Youden′s指数，比较3种方法诊断EBV急性感染的灵敏度、特异度以及ROC曲线下面积(AUC)，评价不同方法的诊断效能。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 精密度 低、中和高值标本批内CV分别为5.7%、3.9%和2.6%，批间CV分别为11.4%、5.4%和4.2%。

2.2 准确度 理论值与实测值间的回归方程为Y=0.090 4+1.005 2X，相关系数r=0.998(P<0.001)，回收率为95.3%～104.8%(见表1)，表明测定结果与理论值具有良好的一致性。

表1 EBV-VCA IgM检测回收率测定结果

Table 1 The results of recoveries of EBV-VCA IgM by CLIA

稀释倍数中值理论值(U/ml)实测值(U/ml)回收率(%)高值理论值(U/ml)实测值(U/ml) 回收率(%)原浓度-824--1846-1∶241243210489238919651∶420619795446247310241∶8103106103123124210481∶1652519861151139841∶32262595358556958

注：-为无此数值

2.3 干扰试验 当标本中血红蛋白水平达8 g/L，三酰甘油达30 000 mg/L时，均不干扰CLIA检测结果，且对于常用抗凝剂如肝素(500 U/ml)、乙二胺四乙酸(EDTA)(1.8 mg/ml)及枸橼酸盐(3.2%枸橼酸钾，1∶9)等，在正常抗凝剂用量时对检测结果均未见明显影响。

2.4 CLIA、ELFA和ELISA诊断EBV急性感染的效能比较 CLIA诊断EBV急性感染的灵敏度为94.2%，特异度为91.1%，Youden′s指数为0.853；ELFA诊断EBV急性感染的灵敏度为82.7%，特异度为88.9%，Youden′s指数为0.716，；ELISA诊断EBV急性感染的灵敏度为80.8%，特异度为91.1%，Youden′s指数为0.719(见表2～4)。

表2 CLIA对EBV急性感染的诊断效能

Table 2 Diagnostic efficacy of CLIA on acute EBV infection

CLIA金标准EBV急性感染 非EBV急性感染合计阳性49857阴性38285合计5290142

注：EBV=EB病毒，CLIA=化学发光免疫分析法

表3 ELFA对EBV急性感染的诊断效能

Table 3 Diagnostic efficacy of ELFA on acute EBV infection

ELFA金标准EBV急性感染非EBV急性感染合计阳性431053阴性98089合计5290142

注：ELFA=酶联荧光分析法

表4 ELISA对EBV急性感染的诊断效能

Table 4 Diagnostic efficacy of ELISA on acute EBV infection

ELISA金标准EBV急性感染非EBV急性感染合计阳性42850阴性108292合计5290142

注：ELISA=酶联免疫吸附试验

CLIA诊断EBV急性感染的AUC为0.962〔SE=0.021，95%CI(0.920，1.004)〕；ELFA诊断EBV急性感染的AUC为0.960〔SE=0.015，95%CI(0.911，0.990)〕；ELISA诊断EBV急性感染的AUC为0.882〔SE=0.031，95%CI(0.823，0.942)〕(见图1)。ROC曲线显示，CLIA诊断EBV急性感染的最佳诊断界值为41 U/ml，灵敏度为96.2%，特异度为99.7%，Youden′s指数为0.959；ELFA诊断EBV急性感染的最佳诊断界值为0.19，灵敏度为88.5%，特异度为98.9%，Youden′s指数为0.874；ELISA诊断EBV急性感染的最佳诊断界值是1.0，灵敏度为82.7%，特异度为86.7%，Youden′s指数为0.694。

图1 3种方法诊断EBV急性感染的ROC曲线

Figure 1 ROC curve of CLIA，ELFA and ELISA on diagnosing the acute EBV infection

3 讨论

EBV属于双链DNA病毒，人是其唯一天然宿主。人在感染EBV后，可引起特异性的淋巴组织增生性疾病，临床症状多不典型，表现形式多样，主要与传染性单核细胞增多症、Burkitt淋巴瘤及鼻咽癌等有关，因此，其诊断需要依赖于实验室检查。本病毒难以分离培养，给临床诊断带来困难。血清学抗体检测是目前临床诊断EBV急性感染的主要依据之一[5]，其中以EBV-VCA IgM最为常用，在EBV急性感染后最早出现，随后产生EBV-VCA IgG，部分人群可能出现一过性的EA-IgG。EBV-VCA IgM在发病后出现早、消失快，具有较高的敏感度和特异度，临床常用于EBV急性感染的早期诊断[6]。国内主要采用ELISA法检测[3，7]，需手工操作，且各试剂厂商间差异较大，灵敏度较低，尤其针对EBV感染早期或免疫功能缺陷患者，如骨髓移植后及自身免疫疾病患者等，此类患者自身免疫系统抑制或缺陷，同时使用免疫抑制剂，机体免疫系统产生抗体的水平相对较低，ELISA法的灵敏度较低，可能导致此类患者漏检，ELIFA检测的临床应用文献报道不一[3，7]。因此，需要灵敏度更好的方法检测体内低水平的抗体含量。CLIA利用抗原-抗体反应及磁珠放大系统，其灵敏度高，特异度亦与ELISA法相当[8]，采用CLIA可显著提高对免疫抑制或缺陷患者EBV-VCA IgM的检出率，本研究结果亦显示，CLIA检测的批内及批间CV均<5%，同时具有良好的抗干扰能力，溶血、脂血对其测定影响小。相比其他检测方法，CLIA的操作更为简便、结果判断不受主观因素的影响，且完全实现了自动化。

本研究结果显示，CLIA的AUC大于ELFA和ELISA(0.962>0.960>0.882)。在最佳诊断界值时，CLIA的灵敏度和特异度均高于ELFA和ELISA，但低于国外报道的98.7%和97.3%[9-10]，可能与本研究EBV急性感染患者部分为骨髓移植后及与自身免疫疾病有关，此外，地域性差异亦可能导致此类情况的产生。本研究依据CLIA ROC曲线得到最佳诊断界值为41 U/ml，与实际应用>40 U/ml近似，因此，以>40 U/ml作为界值，可应用于临床。

综上，与ELFA、ELISA法相比，CLIA用于临床检测EBV-VCA IgM具有简便、快速，灵敏度和特异度较好，且可进行定量检测，有助于提高临床EBV急性感染的诊断。

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注：BMI=体质指数，LVEF=左心室射血分数，Scr=血肌酐，BUN=尿素氮

表2 3组基本资料比较〔n(%)〕

注：CHD=冠心病

表3 3组患者手术前后血清Cys-C水平比较

注：与术前1天比较，*P<0.05；与对照组比较，△P<0.05

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(收稿日期：2014-09-20；

修回日期：2014-12-14)

(本文编辑：贾萌萌)

Research of Laboratory Serological Diagnostic Method for Acute EB Virus Infection

LONGYan，LIUChang，SUNYuan-yuan，etal.

DepartmentofClinicalLaboratory，PekingUniversityPeople′sHospital，Beijing100044，China

Objective To appraise the methodology of anti EBV-VCA IgM assay by CLIA and compare its diagnostic effect of acute EBV virus infection with ELFA and ELISA.Methods 142 cases of origin-unknown fever in Peking University People′s Hospital from May，2011 to October，2012 were selected as the research subjects.3 ml of venous blood was drawn with separation gel vacuum collective tube and blood serum was separated for detecting EBV-VCA IgM by CLIA，ELFA and ELISA.The diagnostic effects of the three methods were compared and methodology evaluation was then performed for the detection by CLIA.Results The coefficients of variation(CV)of low，middle and high value of CLIA(25.8，81.8，184.4 U/ml)in one batch inside were 5.7%，3.9% and 2.6% respectively and in different batches separately were 11.4%，5.4% and 4.2% respectively.The regression equation between expected values and measured values was Y=0.090 4+1.005 2X (r=0.998，P<0.001)and the recovery rate was 95.3%-104.8%；hemoglobin level reaching 8 g/L and triglyceride reaching 30 000 mg/L did not interfere with CLIA.The sensitivity of CLIA，ELFA and ELISA in diagnosing acute EBV infection were 94.2%，82.7% and 80.8% separately，the specificity of the three were 91.1%，88.9% and 91.1% separately and the Youden′s index were 0.853，0.716 and 0.719 separately.The AUC of CLIA for diagnosing acute EBV infection was 0.962〔SE=0.021，95%CI(0.920，1.004)〕，the AUC of ELFA and ELISA were 0.960〔SE=0.015，95%CI(0.911，0.990)〕and 0.882〔SE=0.031，95%CI(0.823，0.942)〕respectively.ROC curve showed that the best diagnostic threshold was 41 U/ml，the sensitivity was 96.2%，specificity was 99.7% and Youden′s index was 0.959.Conclusion CLIA is a more sensitive quantitative method for EB-VCA IgM detection，and is superior to ELFA and ELISA.It is suitable for the early clinical diagnosis of acute EBV infection.

Epstein-barr virus infections；Luminescent measurements；Enzyme-linked immunosorbent assay；Enzyme-linked fluorescent assay

100044北京市，北京大学人民医院检验科

赵晓涛，100044北京市，北京大学人民医院检验科；E-mail：zhaoxt@bjmu.edu.cn

R 512.99

B

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.05.022

2014-09-21；< class="picture_table_title">修回日期：2014-12-30) (本文编辑：贾萌萌)

2014-12-30) (本文编辑：贾萌萌)

Table1Comparisonofgeneraldataamong3groups

组别例数年龄(岁)BMI(kg/m2)LVEF(%)Scr(μmol/L)BUN(mmol/L)对照组20557±60216±2158±7654±15162±16未接受PCI组30552±60214±2758±7577±13563±14PCI组30539±73216±2657±7571±13661±16F值03370622003907140470P值07150540096104930627