香烟提取物对大鼠骨骼肌细胞肌肉生长抑制素表达的影响研究

邓俊亮，吴 健，杨士芳



香烟提取物对大鼠骨骼肌细胞肌肉生长抑制素表达的影响研究

邓俊亮，吴 健，杨士芳

目的 探讨香烟提取物(CSE)对骨骼肌细胞肌肉生长抑制素(MSTN)表达的影响。方法 取新生3～5 d的SD大鼠的骨骼肌组织，用含150 ml/L胎牛血清的高糖DMEM培养基在37 ℃、5%CO2培养箱内进行体外原代细胞培养和传代。采用免疫荧光鉴定检测骨骼肌细胞。选择恰当的CSE浓度(2.5%、5.0%、10.0%)刺激48 h，分为2.5%组、5.0%组、10.0%组和对照组(不予CSE刺激)，分别采用实时定量PCR 检测MSTN mRNA的表达水平与Western blotting 检测MSTN蛋白的表达水平。结果 骨骼肌细胞培养成活率高，体外生长、增殖良好。实时定量PCR 检测结果显示，4组MSTN mRNA 相对表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中，5.0%组、10.0%组MSTN mRNA 相对表达水平高于对照组和2.5%组(P<0.05)。Western blotting检测结果显示，4组MSTN蛋白表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中，5.0%组、10.0%组MSTN蛋白表达水平高于对照组和2.5%组(P<0.05)。结论 骨骼肌细胞模型可对CSE刺激产生有效反应，为吸烟引起骨骼肌抑制的机制研究奠定了细胞学基础。

肌肉生长抑制素；肺疾病，慢性阻塞性；肌细胞；骨骼；大鼠

邓俊亮，吴健，杨士芳.香烟提取物对大鼠骨骼肌细胞肌肉生长抑制素表达的影响研究[J].中国全科医学，2015，18(12)：1401-1405.[www.chinagp.net]

Deng JL,Wu J,Yang SF.Influence of cigarettes smoke extract on the expression of MSTN in SD rat skeletal muscle cells[J].Chinese General Practice，2015，18(12)：1401-1405.

目前，慢性阻塞性肺疾病(COPD)仍然是一个重要的公共卫生问题；我国40岁以上人群COPD患病率为8.2%，每年致残人数达500～1 000万，致死人数达100万。到2020年，COPD将成为世界第三大死亡原因，居世界经济负担第5位[1]。迄今为止，吸烟是引起COPD 的主要危险因素[2]。COPD不仅累及肺脏，同时也涉及多器官受损，包括骨骼肌功能障碍(SMD)和其他系统(如心血管系统、神经系统、消化系统等)功能障碍。肌肉生长抑制素(myostatin，MSTN)主要表达于骨骼肌，其主要作用为抑制肌肉的生长发育，导致肌肉消耗和萎缩[3]。正常情况下，MSTN以无活性的形式存在，在酸血症、氧化损伤、使用糖皮质激素[4]、缺氧[5]等高危因素下均可通过直接或间接途径激活，刺激MSTN高表达；而COPD患者存在缺氧、CO2潴留、使用糖皮质激素等条件。研究证明，MSTN在COPD患者血中高表达，促使骨骼肌消耗及功能障碍[6]。香烟、COPD、MSTN、SMD存在关联。本研究旨在观察大鼠骨骼肌细胞经香烟提取物(CSE)刺激形成COPD模型后MSTN的表达水平，并初步评价其在COPD患者SMD中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器 新生3～5 d的SD大鼠6只，雌雄1∶1，购于中山大学实验动物中心，SPF级。15%胎牛血清(Mediatech,美国)，高糖DMEM(Gibco,美国),引物(TaKaRa,日本)，鼠抗MSTN一抗(R&D 公司,美国)，鼠抗β-actin组蛋白一抗(DSHB，美国)，驴抗羊IgG 二抗(Sigma,美国)，TRIizol(Molecular,美国)，生物发光显色剂(碧云天生物技术研究所,中国)。CO2培养箱(SANYO,日本)，倒置显微镜(Olympus,日本)，PTC 200 RT-PCR仪(MJ Research,美国)，LAS-500(富士山,日本)，聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳及转膜装置(Bio-Rad 公司,美国)。

1.2 方法

1.2.1 原代细胞培养 术前培养瓶包被多聚L赖氨酸[7]，将新生SD大鼠拉颈处死，取双侧大腿肌肉，去脂肪、血液、结缔组织，剪碎至1 mm3。

1.2.1.1 组织块培养 将碎块移入培养瓶，0.3 cm间距，翻转放置37 ℃、5%CO2培养箱培养3～5 h；从无细胞面加入15%胎牛血清培养基，再翻转，放置37 ℃、5%CO2培养箱培养，每天换液[8]；约3 d，细胞覆盖瓶壁70%以上，传代。

1.2.1.2 单层细胞培养 将碎块移入小烧瓶，加入0.25%胰蛋白酶，放置37 ℃水浴杯20 min；加入15%胎牛血清培养基，1 000 r/min(离心半径20 cm)，离心10 min，吸出上清液；上述重复2～3次，集合上清液依次滤过100目、200目筛网，离心后弃上清液，加入15%胎牛血清培养基，重新接种培养瓶(细胞浓度5×105/ml)；放置37 ℃、5%CO2培养箱培养，每天换液[9]。约1周，细胞覆盖瓶壁70%以上，传代。并在倒置显微镜下观察细胞的形态。

1.2.2 免疫荧光鉴定 取第3、4代骨骼肌细胞滴加于盖玻片上，放置37 ℃、5%CO2培养箱培养，定期换液。当增殖70%密度后取出细胞爬片，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次。4%多聚甲醛固定，室温20 min，PBS 洗涤3 次，5 min /次；0.3%PBS-曲拉通通透，室温20 min，PBS洗涤3次，5 min /次；再用正常山羊血清封闭非特异性位点，室温30 min；每张切片样本中加入一抗(兔抗大鼠α1-action 1∶50)，置于湿盒中4 ℃过夜，PBS 洗涤3 次，5 min /次；二抗〔羊抗兔-异硫氰酸荧光素(FITC)1∶300〕置于湿盒中室温避光孵育2 h，PBS 洗涤3次，5 min/次；最后加入含4 ′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的抗荧光猝灭封片剂封片，4 ℃保存，免疫荧光镜下观察并摄片。

1.2.3 CSE的制备 按金常娥等[10]方法制作CSE，选用市售红双喜香烟(广东中烟工业公司)，烤烟型，每支香烟焦油含量11 mg，烟气烟碱含量1.0 mg，烟气一氧化碳含量13 mg。将1支香烟点燃，其过滤嘴端接1根玻璃管，玻璃管的另一端接橡胶管、50 ml注射器；点燃香烟，每次吸50 ml，共收集12管 600 ml烟雾，将烟雾注入含25 ml PBS的玻璃瓶中，即为100%原液；均于使用前30 min制备，用0.22 μm微孔滤膜过滤去除细菌和大颗粒。

1.2.4 CSE浓度选择 分别制成体积比(V/V)为1%、2%、4%、6%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、98%CSE浓度的15%胎牛血清高糖DMEM培养液。6孔板细胞覆盖瓶壁50%以上，分别加入上述添加CSE的培养液，放置37 ℃、5%CO2培养箱培养，每天换液；分别于6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72 h在倒置显微镜下动态观察细胞生长情况，并拍照为证。结果1%～10% CSE刺激的细胞在72 h后仍贴壁生长；≥15% CSE刺激的细胞6 h开始出现细胞质回缩、细胞变圆球形、细胞间隙增大现象，12 h后出现细胞悬浮；上述情况进行性加重，在24 h后，细胞完全悬浮；考虑贴壁细胞已经死亡。上述处理4次。本实验要求细胞在CSE中生长48 h,所以只能先用10%以内的浓度，为了容易观察实验，故选择2.5%、5.0%、10.0%CSE。

1.2.5 实时定量PCR 检测MSTN mRNA的表达 在骨骼肌细胞长满细胞覆盖瓶壁70%以上后分为2.5%组、5.0%组、10.0%组和对照组(不予CSE刺激)。用TRIzol裂解，常规提取总RNA，D260 nm/D280 nm值进行RNA 定量和质量检测，采用三步法实时定量PCR检测MSTN mRNA的表达水平。根据基因库中SD大鼠MSTN碱基序列，设计其基因部分片段的扩增引物，MSTN上游引物：5′-ATTATCACGCTACCACGGAAACA-3′；下游引物：5′-AGCTGGGCCTTTACCACTTTG-3′。反转录程序:42 ℃ 延伸60 min，72 ℃变性5 min，12 ℃维持。PCR 反应程序为:95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共40个循环，4 ℃维持。扩增产物经PTC 200 RT-PCR 仪处理，作mRNA的相对含量〔将甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参照而求得的相对含量〕，以2-ΔΔCT表示。检测13次。

1.2.6 Western blotting 检测MSTN蛋白的表达 采用十二烷基硫酸钠(SDS)蛋白裂解液分别提取48 h 时相的各组骨骼肌细胞的总蛋白，并用BCA试剂盒进行蛋白定量；行12%SDS-PAGE凝胶电泳，以β-actin蛋白为内参，然后将蛋白转印至聚偏氟乙烯膜(PDVF)，用TBST(Tris-buffered saline-Tween) 配制的5%脱脂奶粉低速室温封闭1 h；用5%脱脂奶粉封闭液稀释的鼠抗MSTN一抗(1∶100)和鼠抗β-actin组蛋白一抗(1∶1 000)4 ℃过夜；用1×TBST于脱色摇床中洗涤3次，15 min、5 min、5 min；再以5%脱脂奶粉稀释辣根过氧化酶标记的驴抗羊IgG二抗(1∶5 000) 4 ℃孵育3 h;最后用1×TBST于脱色摇床中洗涤3 次，10 min/次；在暗室中进行生物发光显色，暗室曝光。检测33次。

2 结果

2.1 骨骼肌细胞培养的形态学观察 倒置显微镜下可见，骨骼肌细胞刚铺板于15%胎牛血清培养基时细胞呈圆形，形态均一，折光性强，悬浮于培养基中；5～6 h后开始贴壁，24 h后完全贴壁，并开始增生，细胞逐渐延伸成梭形，相互融合，按一定方向有序排列。随细胞密度的增加,细胞逐渐有规律地平行排列；培养至2～3 d 时细胞分化达到高峰，随后逐渐开始凋亡、漂浮(见图1)。

2.2 免疫荧光鉴定 将分化成熟的细胞，行α1-action免疫荧光染色，90%以上的细胞呈阳性反应，细胞核染成蓝色，表明培养的细胞为骨骼肌细胞(见图2)。

图1 骨骼肌细胞培养的形态学观察(×20)

图2 骨骼肌细胞的免疫荧光鉴定(×200)

2.3 MSTN mRNA相对表达水平 实时定量PCR 检测结果显示，4组MSTN mRNA 相对表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中，5.0%组、10.0%组MSTN mRNA 相对表达水平高于对照组和2.5%组，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.4 MSTN蛋白表达水平 Western blotting检测结果显示，4组MSTN蛋白表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中，5.0%组、10.0%组MSTN蛋白表达水平高于对照组和2.5%组，差异有统计学意义(P<0.05，见表2、图3)。

Table 1 Comparison of relative expression level of MSTN mRNA among four groups

组别例数MSTNmRNA相对表达水平对照组131.000±0 2.5%组131.767±1.416 5.0%组134.936±4.950*△10.0%组115.460±6.067*△F值4.113P值0.011

注：MSTN=肌肉生长抑制素；与对照组比较，*P<0.05；与2.5%组比较，△P<0.05

表2 4组MSTN蛋白表达水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与2.5%组比较，△P<0.05

注：MSTN=肌肉生长抑制素

图3 CSE刺激48 h 后MSTN蛋白的表达

Figure 3 The expression of MSTN proteins after 48 h of CSE stimulation

3 讨论

COPD患者中90%是吸烟者或曾经有过吸烟史[11]。香烟产生的大量活性氧(ROS)可导致氧化应激。有证据显示，COPD患者骨骼肌组织的氧化应激明显增加，且这种增加与其活动能力和活动耐力呈负相关[12]。与同年龄的健康对照者相比，COPD患者骨骼肌力量下降[13]，且下肢比上肢明显，尤其股四头肌的耐力明显下降[14]，而且抗氧化治疗可以改善COPD患者的骨骼肌活动耐力[15]。故可以认为，香烟产生ROS导致氧化应激，作用于骨骼肌产生SMD。

呼吸系统不仅是氧化应激的主要靶器官，ROS可以随着血液循环分布于全身各个脏器，作为人体最大体积的一种器官组织——肌肉组织，同样也是氧化应激的“受害者”。过去一直认为COPD患者出现运动受限主要是因为肺功能受损所致。但近年来越来越多的研究发现，在运动受限的COPD患者中，约40%患者肺功能并没有严重受损，而表现为明显的SMD[16-17]。研究表明，COPD患者常见骨骼肌无力，可早于恶病质；晚期COPD患者骨骼肌明显萎缩，与呼吸功能、活动耐量、健康状态和病死率增加有关[18]。膈肌和股四头肌中的MSTN高表达[19-20]。再者，COPD患者肌肉的毛细血管密度[21]及代谢活性均下降[22]。因此推断，CSE可导致MSNT水平升高，骨骼肌消耗和萎缩；最终导致肌肉耐力、速度下降，加剧呼吸肌无力，与COPD呈正相关。

本实验采用香烟烟雾暴露建立SD大鼠的COPD模型。研究结果显示，与对照组比较，5.0%组和10.0%组骨骼肌细胞MSTN mRNA相对表达水平和MSTN蛋白表达水平均增高。

COPD是一种慢性系统性炎症反应性疾病，常见症状是全身骨骼肌消耗，呼吸肌作为最重要的骨骼肌之一，与生命息息相关。呼吸肌消耗及功能障碍导致的呼吸衰竭是许多疾病晚期死亡的主要原因。而膈肌作为主要呼吸肌，MSTN抗体可使膈肌修复，长期使用则可改善膈肌形态并促进其收缩功能[23]。目前,COPD患者SMD尚未得到足够重视，对于改善骨骼肌功能障碍状态以缓解COPD临床症状的研究较少；且尚未发现更为有效的方法来阻止或逆转其发展。因此，通过对大鼠骨骼肌细胞MSTN的表达水平实验，了解其在呼吸肌中的变化；有望为COPD患者提供以MSTN作为靶向目标的治疗前景[24]，为COPD患者提供更好、更全面的治疗，改善预后，提高生活质量。

综上所述，本研究从细胞模型水平，采用分子生物学和生理学的方法，研究MSTN参与COPD患者SMD发病的机制，为进一步阐明COPD患者SMD的发病机制并对其进行治疗提供新的思路及策略。再者，证实香烟对骨骼肌的毒性作用，戒烟是防治COPD/肺气肿的重要有效措施，具有重要的临床和社会价值。

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(本文编辑：陈素芳)

Influence of Cigarettes Smoke Extract on the Expression of MSTN in SD Rat Skeletal Muscle Cells

DENGJun-liang,WUJian,YANGShi-fang.

SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China

Objective To investigate the influence of cigarettes smoke extract(CSE) on the expression of MSTN in skeletal muscle cells.Methods The skeletal muscle tissues from newborn SD rat within 3-5 days old,were cultured and subcultured in high glucose DMEM with 150 ml/L fetal bovine serum in a incubator for proliferation in vitro.The skeletal muscle cells were detected by immunofluorescence technology.The skeletal muscle cells were treated with different levels of CSE(2.5%,5.0%,10.0%) for 48 h,and according to CSE concentration,skeletal muscle cells were divided into 2.5% group,5.0% group,10.0% group,and control group(cells were not treated with CSE) respectively.The expression of MSTN mRNA was detected by RT-PCR,and the expression of MSTN proteins was detected by Western blotting technology.Results The survival rate of skeletal muscle cells was high in vitro,and the growth and proliferation status was good.According to RT-PCR results,there were significant differences in relative expression level of MSTN mRNA among four groups(P<0.05).The relative expression level of MSTN mRNA in 5.0% group and in 10.0% group was significantly higher than that in control group and in 2.5% group,respectively(P<0.05).According to Western blotting results,there were significant differences in expression level of MSTN proteins among four groups(P<0.05).The expression level of MSTN proteins in 5.0% group and in 10.0% group was significantly higher than that in control group and in 2.5% group,respectively(P<0.05).Conclusion Skeletal muscle cell model can effectively respond to CSE stimulation,which provides cytological basis for mechanism research on cigarettes smoke-induced skeletal muscle inhibition.

Myostatin；Pulmonary disease,chronic obstructive；Muscle cells；Skeleton；Rats

国家自然科学基金资助项目(81300034)

510515广东省广州市，南方医科大学(邓俊亮)；广东省人民医院呼吸科(吴健，杨士芳)

吴健,510080广东省广州市，广东省人民医院呼吸科；E-mail：wujian67@aliyun.com

R 563

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.12.011

2014-11-16；

2015-01-25)