色氨酸与2,6-二氯醌氯亚胺荷移荧光光谱法的研究

周琳

（太原师范学院化学系 山西太原 030031）

色氨酸化学名称为氨基吲哚基丙酸，是人体八种必需氨基酸之一。它在动物体内不能自行合成，而且动物体内各组织中含量都较低。色氨酸有许多生理生化功能，主要是促进肝微粒体部分能，它还以结合态存在于组织细胞中，起控制神经系统的作用。色氨酸系氨基酸类药物，对抑郁症、失眠症、高血压及止痛等有良好疗效，临床应用广泛[1]。目前，定量测定色氨酸的方法主要有：吸光光度法、荧光光谱法、流动注射化学发光法、荷移分光光度法、高效液相色谱法等[2-4]。用荧光猝灭法研究色氨酸与2,6-二氯醌氯亚胺(DBQ）的荷移反应未见报道，本文研究了色氨酸与DBQ 在三酸缓冲介质中发生荷移反应，形成荷移络合物的最佳条件，旨在建立一种测定色氨酸含量的荷移荧光分光光度新方法。

一、实验研究

1.实验主要仪器及试剂

仪器 WGY-10 型荧光分光光度计；PE 公司LS55 荧光分光光度计；HH-6 电热恒温水浴锅；92M-202A-DR 电子天平；211-酸度计(意大利Hanna)；XYJ-802 离心沉淀机等。

试剂 L-色氨酸；DBQ；磷酸(AR)；冰醋酸(AR)；硼酸(AR)等。

2.实验过程

（1）溶液的配制

L-色氨酸标准溶液：准确称量L-色氨酸0.10220g，用水溶解，转入100mL 容量瓶中，然后用水定容至刻度，配成1.0220g/L 的标准溶液，放于冰箱中避光保存，操作液由贮备液稀释配制。用时配成1.0220×10-2g/L 的水溶液。

DBQ 乙醇溶液：准确称取0.24979g 2,6-二氯醌氯亚胺，用无水乙醇溶解，转移到250mL 棕色的容量瓶中，用无水乙醇定容到刻度，配成1g/L 的溶液。用时配成0.1g/L 的乙醇溶液。

pH=11.0的三酸缓冲溶液：分别取2.70 mL磷酸、2.29mL冰醋酸、2.47g 硼酸于1000 mL 容量瓶中并用水稀释至刻度，在酸度计下，用0.2mol/L 的氢氧化钠调节至pH=11.0。

（2）实验方法

准确移取适量色氨酸溶液于10mL 比色管中，用pH=11.0 的三酸缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，在室温下反应15min 后，用1cm 石英荧光池，以280nm 为激发波长，在波长为360nm 处测量溶液发射强度F1。

准确移取适量色氨酸溶液于10mL 比色管中，加1.0 mL DBQ乙醇溶液，用pH=11.0的三酸缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，在室温下反应15min 后，加入1cm 石英荧光池中，以280nm 为激发波长，在波长为360 nm 处测量溶液发射强度F2。计算荧光猝灭量△F = F1-F2。

二、结果与讨论

1.条件的选择

（1）用荧光分光光度计对水、DBQ 的乙醇溶液、色氨酸溶液、色氨酸-DBQ 溶液进行激发和发射光谱扫描，结果表明，水、DBQ 对测定无干扰，实验分别选择色氨酸溶液的激发峰和发射峰280 nm 和360 nm 作为激发波长和发射波长；

图2 发射光谱图

图1 激发光谱图

（2）选用不同的溶剂配制溶液，测定相应色氨酸、色氨酸-DBQ 体系的荧光强度发现，甲醇中荧光猝灭程度比水介质中的荧光猝灭程度稍大，但水价廉无污染，故选用水为溶剂。

（3）选用不同温度下不同反应时间进行测定，结果显示在室温 (19.8℃) 下反应15min 后，荧光猝灭量变化很小，反应达到平衡，在90 min 内色氨酸的荧光强度变化不多。在30℃和40℃时反应虽很快达到平衡，但色氨酸的荧光强度逐渐减小，故选反应温度为19.8℃，反应时间为15min。

（4）改变试剂DBQ 乙醇溶液的用量进行测定发现，当DBQ 乙醇溶液为1.0 mL 时，荧光猝灭程度最大，故选择其用量为1.0mL。

（5）用pH 为0.00-14.00 的三酸缓冲溶液稀释到刻度进行测定发现，色氨酸的荧光强度受溶液的酸碱度的影响非常显著，随着pH的增加，色氨酸的荧光强度呈增长趋势，色氨酸在碱性介质中自体荧光很强。pH=11.00 时荧光强度达到最大，DBQ 对色氨酸的荧光猝灭效应也最大，故选用pH=11.00 的三酸缓冲溶液。

（6）准确加入1 mL 0.1mol/L 不同种类的表面活性剂进行测定发现，不加表面活性剂的反应体系荧光强度的猝灭量最大，因此该实验不选用表面活性剂。

（7）按照不同顺序加样进行测定，表明DBQ +色氨酸+ pH=11.0 的三酸缓冲溶液的顺序效果最佳。

2.精密度的测定

在选定的最佳条件下，对含有0.51μg/mL 的色氨酸溶液，按照实验方法平行测定15 次，结果表明，其标准偏差为0.256，相对标准偏差为1.3%。

3.工作曲线的绘制

准确移取不同量的色氨酸溶液，在选定的最佳条件下反应后进行测定，并绘制工作曲线，结果显示，色氨酸的含量在0.51 ～1.33μg/mL 时荧光强度差值与色氨酸的含量呈良好的线性关系，线性回归方程为△F =0.9251+37.647c（单位为μg/mL），相关系数R=0.9990。进行计算，得到方法的检测限为0.02μg/mL，即在信噪比为3 时，其检测限为0.02μg/mL。

4.共存物质的影响

在选定的最佳条件下，对于测定10mL 溶液中10μg的色氨酸，在反应体系中加入1.0mL 浓度均为0.5g/L 的8种不同的干扰试剂进行测定，结果表明，在10μg 的色氨酸存在下，加入量均为500μg 的KCl，NaCl，葡萄糖，蔗糖，荧光测定值误差小于±5%，其中葡萄糖的干扰程度最小；而加入量均为500μg 的苯丙氨酸，酪氨酸，Ni(NO3)2· 6H2O， Ca(NO3)2· 4H2O，荧光测定值误差大于±5%，其中酪氨酸的干扰程度最大。

三、样品测定及回收率实验

1.样品的测定

（1）取血清1.0mL 于10mL 的离心试管中，加入3.0mL的乙醇除蛋白，静置5min，放入XYJ-802 离心沉淀机中，4000r/min,离心10min。

（2）取上清液0.2mL 于10ml 的比色管中，用pH 为11.00 的三酸缓冲溶液稀释到刻度，摇匀；

（3）取上清液0.2mL 于10mL 的比色管中，加入1.0mL DBQ乙醇溶液，用pH为11.00的三酸缓冲溶液稀释到刻度，摇匀，充分混合作用15 min。

测得血清，血清-DBQ 体系的荧光强度均为0。

2.回收率实验

按照样品测定方法在0.2mL 血清中分别加入不同量的0.01g/mL 的色氨酸的标准溶液，用标准加入法测定，血清的回收率为97.5 ～100.6%。

[1]李剑欣，张绪梅，徐琪寿．色氨酸的生理生化作用及其应用[J]．氨基酸和生物资源，2005，27(3)：58 62．

[2]范哲锋，杜黎明，靳晓涛．色氨酸荧光猝灭法测定人发稀土总量[J]．分析化学, 2001，29(9)：1049 1051．

[3]魏永锋，马冬梅，赵琼．比值导数荧光光谱法同时测定色氨酸和5-羟基色氨酸[J]．分析实验室．2006，25(9)：75-77．

[4]夏国华，戚雪勇，傅海珍等．荷移荧光光谱法测定杨树桑黄子实体的总黄酮[J]．光谱实验室．2012，29(4)：2425-2428．