关于降低维生素B12 原料药中内毒素的研究

任静 张京月 吴晓蕊 耿云静

（河北华荣制药有限公司 河北石家庄 050041）

维生素B12 又称钴胺素，现在人们习惯上把氰钴胺叫做维生素B12。自然界中的维生素B12 都是微生物合成的，高等动植物不能制造维生素B12。维生素B12 是需要一种肠道分泌物（内源因子）帮助才能被吸收的一种维生素。维生素B12 的主要生理功能是参与制造骨髓红细胞，防止恶性贫血；防止神经系统受到破坏。随着医疗技术的发展以及对维生素B12 研究的深入，维生素B12 越来越多的药效被发现，给药途径也发生变化。每个客户对维生素B12 的质量要求也各有不同，尤其是注射级制剂用的维生素B12 对内毒素含量要求较高。

内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁外膜上的特有结构，其本质是脂多糖。维生素B12 的生产由微生物发酵法制得，生产过程中必然会带入内毒素。虽然提炼工序可以去除大部分内毒素，但成品中内毒素残留还会在200EU/mg 左右。如何有效降低维生素B12 中内毒素，满足客户要求就成了该行业的重要课题。

本文就以如何有效降低维生素B12 中内毒素为研究对象，通过反复实验，发现一定浓度的维生素B12 进行改性硅胶的精制处理可以将内毒素含量降低到1EU/mg左右。笔者在实验过程中通过对比离子交换树脂、改性氧化铝、改性硅胶、活性炭等不同吸附介质，确立了有效去除维生素B12 内毒素的方法。

一、材料与方法

1.试剂和仪器

直径55×450mm 玻璃树脂柱若干；玻璃棒若干；

2L 玻璃烧杯若干；100ml 量筒若干；500ml 量筒若干；

阴离子交换树脂；改性氧化铝；改性硅胶；活性炭；

PH 计测定仪 PHS-3C；CPA225D 电子天平；比重计；

试剂盐酸；试剂冰乙酸；试剂氢氧化钠；试剂丙酮。

2.试验方法

（1）实验器材预处理

将所有玻璃仪器用6%氢氧化钠溶液处理，并清洗干净待用。

阴离子交换树脂用7%盐酸水溶液及6%的氢氧化钠水溶液处理并水洗至中性。

（2）树脂柱的装填方法

将准备好的阴离子交换树脂 300ml；活性炭300 ml；改性氧化铝300 ml；改性硅胶300 ml 分别装入55×450mm 玻璃树脂柱内。其中阴离子交换树脂、活性炭用纯化水装填；改性氧化铝、改性硅胶用试剂丙酮装填，将装填好的树脂柱置于操作台。

二、维生素B12溶液穿透介质及工艺的选择

1.维生素B12 溶液穿透介质的选择

取同一批维生素B12 成品进行实验。将维生素B12溶解至相同浓度，其中两份用纯化水溶解，分别用离子交换树脂和活性炭穿透，另外两份用丙酮水溶液溶解，分别用改性氧化铝和改性硅胶穿透。将装好的各柱放平液面，以400ml/h 进行穿透。穿透完毕，阴离子交换树脂柱与活性炭柱用纯化水顶洗；改性氧化铝与改性硅胶柱用丙酮水溶液顶洗。分别收集维生素B12 溶液，加丙酮结晶，凉粉，测其内毒素及维生素B12 回收率。

实验结果见表1

表1 不同穿透介质内毒素结果

由上表可见，改性硅胶对维生素B12的内毒素的去除效果最好。

2.维生素B12 溶液穿透工艺的选择

（1）维生素B12 溶液浓度的选择

取同一批维生素B12 成品进行实验。用改性硅胶裝柱5 根，将维生素B12 成品用丙酮水溶液分别溶解至5个浓度5000 ug/ml、8000 ug/ml、10000 ug/ml、12000 ug/ml、15000 ug/ml，以400ml/h 进行穿透。穿透完毕，用丙酮水溶液顶洗。分别收集维生素B12溶液，加丙酮结晶，凉粉，测其内毒素及维生素B12 回收率。

实验结果见表2

表2 不同维生素B12 溶液穿透去除内毒素结果

由上表可见，10000ug/ml 的维生素B12 溶液穿透改性硅胶去除内毒素的效果最好。

（2）维生素B12 溶液有机相比例的选择

取同一批维生素B12 成品进行实验。用改性硅胶裝柱5 根，将维生素B12 成品用丙酮水溶液分别溶解5 份，溶解浓度均为10000ug/ml，但其中有机相与水的比例分别为20%、25%、30%、35%、40%，以400ml/h 进行穿透。穿透完毕，用丙酮水溶液顶洗。分别收集维生素B12溶液，加丙酮结晶，凉粉，测其内毒素及维生素B12 回收率。

实验结果见表3

表3 不同有机相比例溶液穿透效果

由上表可见，10000ug/ml 的维生素B12 溶液（其有机相比例为30%）穿透改性硅胶去除内毒素的效果最好。

（3）改性硅胶装量的选择

取同一批维生素B12 成品进行实验。用改性硅胶裝柱5 根，其中改性硅胶的裝柱量分别为预配置溶液体积的1/20、1/25、1/30、1/35、1/40，将维生素B12 成品用丙酮水溶液溶解5 份，溶解浓度均为10000ug/ml，其中有机相与水的比例均为30%，以400ml/h 进行穿透。穿透完毕，用丙酮水溶液顶洗。分别收集维生素B12 溶液，加丙酮结晶，凉粉，测其内毒素及维生素B12 回收率。

实验结果见表4

表4 不同改性硅胶装量去除内毒素的结果

由上表可见，10000ug/ml 的维生素B12 溶液（其有机相比例为30%）穿透改性硅胶（溶液体积的1/30）去除内毒素的效果最好，且其维生素B12 的回收率最高。

三、结论

按照笔者的方法，使用改性硅胶并控制合适的维生素B12 料液浓度及有机相比例并选取合适的改性硅胶装量，可以把维生素B12 产品中的内毒素降低到1EU/mg的水平，按照维生素B12 注射用量1mg/次计算，该种水平的内毒素含量远远低于注射级用药的标准。这为广大用药患者的安全用药提供了有力保障，为广大用药者带来了福音。