大鼠激素性股骨头坏死模型的建立和评价

董玉雷，周　磊，李玉龙，肖　刻，翁习生

中国医学科学院　北京协和医学院　北京协和医院骨科，北京 100730



大鼠激素性股骨头坏死模型的建立和评价

董玉雷，周磊，李玉龙，肖刻，翁习生

中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院骨科，北京 100730

摘要：目的建立大鼠激素性股骨头坏死动物模型，并进行影像学和病理评价。方法将30只成年雄性SD大鼠随机分为两组：实验组给予腹腔注射两次脂多糖(20 μg/kg)，每次间隔24 h，24 h后肌肉注射大剂量甲强龙(40 mg/kg)，连续注射3次，每次间隔24 h，对照组给予等量生理盐水。4周后两组各随机处死5只大鼠。8周后处死剩余全部大鼠。大鼠双侧股骨标本行微计算机断层扫描，观察骨小梁微观结构变化，计算骨小梁参数。股骨头脱钙处理后行HE染色组织病理学检查。结果根据病理切片结果，实验组有12只出现骨坏死表现，建模成功率80%。4周时实验组病理切片出现空骨陷窝，8周时HE染色可观察到空骨陷窝、骨小梁断裂、纤维结构增生。8周时实验组微计算机断层扫描显示骨小梁结构紊乱、断裂、囊变，骨小梁定量分析显示骨小梁相对体积(实验组:0.55±0.13，对照组:0.68±0.12;P<0.05)、相对面积(实验组:20.45±5.13，对照组:24.00±5.20；P<0.05)、骨小梁数量(实验组:5.67±0.50，对照组:6.24±0.96；P<0.05)等指标明显低于对照组。结论脂多糖联合大剂量甲强龙可成功建立大鼠激素性股骨头坏死动物模型，使用高分辨微计算机断层扫描可进行骨小梁形态和结构的定性定量分析，与HE染色病理切片具有较好的一致性。

关键词：糖皮质激素；股骨头坏死；微计算机断层扫描

ActaAcadMedSin，2015,37(2)：152-156

糖皮质激素是许多风湿免疫疾病重要的治疗手段，然而激素性股骨头坏死已经成为高发病率、高致残率的疾病。Fukushima等[1]研究显示激素性股骨头坏死已居非创伤性股骨头坏死的首位(51%)。其确切的发病机制尚不明确。建立科学的股骨头坏死动物模型对研究股骨头坏死具有重要的意义。目前的股骨头坏死动物模型较多[2]，但造模方式及评价方法仍然未达成一致。高分辨微计算机断层扫描可以清楚地观察骨小梁形态，结合软件重建分析能够定量分析骨小梁参数，已经成为骨形态计量学研究的重要工具[3]。本研究通过脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)联合甲强松建立大鼠股骨头坏死动物模型，并使用micro-CT进行定性定量评价，结合HE染色组织形态学检查，建立和评价大鼠激素性股骨头坏死模型。

材料和方法

实验动物及模型制作成年雄性SD大鼠由北京维通利华公司提供，共30只，年龄12周，体重400～450 g，在中国医学科学院肿瘤医院动物房按照标准饲养条件饲养，温度22～26 ℃，湿度37%～42%，光照按12 h昼夜交替，自由摄食饮水，每笼2只。适应性喂养1周后随机分为两组，每组15只，精确称重后，实验组腹腔注射LPS(20 μg/kg，美国Sigma公司)两次，每次间隔24 h。24 h后两侧臀肌交替注射甲强龙(40 mg/kg，美国辉瑞公司)3次，每次间隔24 h。对照组腹腔及臀肌注射生理盐水。饲养4周后每组随机处死5只，取出双侧股骨标本，中性甲醛溶液固定，继续饲养至8周后处死剩余全部大鼠，取出双侧股骨标本，中性甲醛溶液固定。

Micro-CT检查Micro-CT由中国医学科学院实验动物研究所完成，使用Siemens小动物micro-PET/CT行股骨近端扫描并使用Inveon工作站软件进行三维重建。扫描电压为60 kV，电流400 μA，扫描长度20 mm，分辨率10 μm，使用Inveon analysis工作站进行重建，选取股骨头冠状面骨骺线中点下方1 mm内的全部50个层面作为感兴趣区域进行骨小梁参数分析(图1)。随后，骨体积/总体积、骨面积/骨体积、骨小梁厚度、骨小梁数量通过软件自动计算。

组织病理学检查将股骨置入中性甲醛溶液固定72 h后，使用30% 甲酸脱钙3 d，脱钙完全后梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片厚度4 μm，常规HE染色，使用显微镜在100倍视野下观察。股骨头坏死的诊断标准为空骨陷窝形成或骨细胞核固缩，伴有周围骨髓细胞坏死[4]。具有至少1处坏死病灶的大鼠可以认为出现股骨头坏死。

结果

大体观察结果所有大鼠均存活，未出现明显并发症。成年大鼠股骨头直径约2 mm，表面覆盖一层软骨。实验组股骨头可见软骨下坏死灶，颜色暗红。对照组股骨头软骨光滑，颜色均一(图2)。

A.横断面手动区分皮质骨和松质骨，骨小梁和骨髓通过阈值功能自动区分；B.冠状面显示感兴趣区域

A.on the cross-section the cortical bone and spongy bone were separated manually，and the trabeculae and the bone marrow were separated automatically by the threshold function；B.the region of interest shown in the coronary view

图 1微计算机断层扫描骨小梁参数分析时感兴趣区域的选择和分析

Fig 1The region of interest chosen and the identification of trabeculae in micro-CT

A.实验组，可见到片状软骨下出血坏死，软骨较薄；B对照组，软骨面光滑，颜色均一

A.the femoral head from the experimental group showed necrotic lesion of the bone under the relatively thin cartilage；B.the femoral head from the control group showed relatively smooth and white cartilage

图 24周时大鼠股骨头坏死大体标本

Fig 2The gross specimen observation of the femoral head at 4 weeks

Micro-CT结果8周时实验组大鼠股骨头可见到软骨面变薄，软骨下骨坏死、囊变，骨小梁稀疏。对照组软骨面均匀，厚度大，软骨下松质骨骨小梁致密、排列有序(图3)。定量分析股骨头中心单位体积内的松质骨骨小梁参数，结果显示实验组的骨小梁相对体积、面积、数量均明显低于对照组(P=0.002，P=0.036，P=0.024)。骨小梁厚度两组比较差异无统计学意义(P=0.388)(表1)。

组织病理学变化4周时可见实验组有空骨陷窝形成，而对照组骨细胞及细胞核染色均匀。8周时实验组可见骨小梁断裂，排列紊乱，骨小梁间距增大，空骨陷窝明显增多，有点状骨髓坏死出血，并出现纤维结构增生。根据股骨头坏死诊断标准，实验组4周时有4/5只出现股骨头坏死，8周时有8/10只出现骨坏死，共有12/15只出现股骨头坏死，建模成功率为80%。对照组骨小梁排列规律，间隔较小，软骨面光滑(图4)。

A.造模组，显示股骨头软骨下骨坏死，部分囊变，骨小梁稀疏；B.对照组，显示股骨头形态良好，骨小梁致密

A.the femoral head from the experimental group showed necrotic lesion under the cartilage，the cystic lesion formed，and the trabeculae were few and scattered；B.the femoral head from the control group did not show any obvious lesion and the trabeculae were fine and close

图 3股骨头微计算机断层扫描二维重建图像

Fig 3The two-dimensional micro-CT reconstruction image of the femoral head

表 1　股骨头感兴趣区域骨小梁参数分析结果对比(x-±s)

图 4股骨头组织病理学染色结果(HE染色，×100)

Fig 4The histopathological appearance of the femoral head(HE stained，×100)

讨论

激素性股骨头坏死的发病机制目前仍不清楚，尚无特异性的治疗手段。建立科学的动物模型对激素性股骨头坏死发病机制的研究具有重要意义。目前股骨头坏死的动物模型包括鸡、鸸鹋、大鼠、兔、犬、羊等[2]。兔比较经济、易于饲养，是最常用的激素性股骨头坏死模型。鸸鹋因其独特的股骨头塌陷现象在髋关节生物力学方面的研究具有重要的意义[5]。但是鸸鹋不是标准实验动物，来源有限，与人类基因差异较大，不适合大规模推广。大鼠体积适中，生理和药理特性与人类非常相近，生长繁殖较快，饲养简便，股骨头大小适合进行影像学和病理学研究，因而是目前重要的股骨头坏死动物模型。由于激素性股骨头坏死主要见于成年人，所以选用成年大鼠能够更好的模拟临床。

股骨头坏死动物模型的造模方法包括异体血清加激素、LPS加激素、单纯激素等[6- 8]。临床上，系统性红斑狼疮、肾病综合征等是应用激素较多且容易发生股骨头坏死的疾病，其共同点是应用激素前体内已出现血液和脉管系统的基础病变。利用LPS或异体血清首先造成动物的免疫反应和血管炎，继而使用激素建模的方式，发生骨坏死时间更早，效果更明显，更符合临床实际，被较多学者采用。本研究采用的是LPS加大剂量甲强龙的方法。剂量与童培建等[9]的报道相同。大于另一些学者的剂量[8，10]。一方面，这和大鼠与兔的物种差异有关；另一方面，大剂量激素的主要副作用是感染导致动物死亡的风险。本研究无1例大鼠出现死亡，这可能与良好饲养环境和较低的饲养密度有关。

近年来，随着小动物影像学检测技术的进步，使小动物股骨头坏死的评价更为精确。本研究采用的Siemens Inveon Micro-PET/CT 还可以进行活体动态成像，分辨率达微米级，可清楚地显示骨小梁等微观结构，同时结合软件可以进行定量分析骨小梁相关参数和骨密度等指标，成为骨质疏松领域和骨形态学领域研究的重要工具[11]。本研究采用的是标本扫描，较活体扫描能够更清晰地显示骨小梁结构，避免动物呼吸带来的伪影。骨小梁参数分析显示骨体积分数和骨小梁数量实验组均明显低于对照组，表明实验组的骨小梁结构出现了破坏，出现了骨质疏松的表现。组织病理学仍然是诊断骨坏死的金标准，股骨头坏死的病理特征早期主要是骨细胞凋亡[12]和骨髓坏死，晚期出现骨小梁结构紊乱、断裂，伴有纤维结构增生。本研究4周时可明显观察到空骨陷窝形成，但骨小梁结构尚可。8周时，已经可以观察到骨小梁结构紊乱断裂，周围纤维结构增生，在微计算机断层扫描显示为囊变，与文献报道一致[4]，表明本研究动物模型能够模拟股骨头坏死的表现。另外，本研究显示微计算机断层扫描能够清晰地显示骨小梁，但是对于早期的骨细胞坏死尚无法显示。随着分子影像学等技术的进步，未来可逐渐取代病理切片用于小动物股骨头坏死的诊断。

本研究建立了大鼠激素性股骨头坏死模型，通过明确的病理切片诊断标准进行评价，无大鼠意外死亡，造模成功率高。配合高分辨微计算机断层扫描，可清晰地显示骨小梁微观结构，同时结合骨小梁参数定量分析，可以定量比较骨小梁体积等数值。本研究不足之处是由于大鼠隔离饲养的限制性，无法对同一只动物进行影像上的动态观察。目前临床上股骨头坏死早期的骨髓水肿主要依据核磁共振成像诊断，而微计算机断层扫描对于早期骨小梁结构正常的股骨头坏死显示效果欠佳，未来使用小动物核磁共振和小动物正电子发射计算机断层扫描，可以对股骨头坏死早期的水肿和异常信号进行检测，能够更敏感和准确判断股骨头坏死。另外，由于大鼠股骨头直径小，且为四足动物，故无法完全模拟出类似人类的股骨头坏死塌陷。所以对于髋关节生物力学相关的研究，可能选择大动物更为适合。

综上，使用LPS加大剂量甲强龙可以诱导成年SD雄性大鼠出现较高的股骨头坏死率，使用微计算机断层扫描和病理切片进行评价，可定性定量显示及分析骨小梁结构和参数，对研究股骨头坏死发病机制及不同干预措施的疗效具有重要的意义。

参考文献

[1]Fukushima W，Fujioka M，Kubo T，et al. Nationwide epidemiologic survey of idiopathic osteonecrosis of the femoral head [J].Clin Orthop Relat Res，2010，468(10)：2715- 2724.

[2]周磊，翁习生.激素性股骨头坏死动物模型的选择与应用[J].中国矫形外科杂志，2013，21(21)：2155- 2158.

[3]Bouxsein ML，Boyd SK，Christiansen BA，et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography[J].J Bone Miner Res，2010，25(7)：1468- 1486.

[4]Irisa T，Yamamoto T，Miyanishi K，et al. Osteonecrosis induced by a single administration of low-dose lipopolysaccharide in rabbits[J].Bone，2001，28(6)：641- 649.

[5]Zheng LZ，Liu Z，Lei M，et al. Steroid-associated hip joint collapse in bipedal emus[J].PLoS One，2013，8(10)：

e76797.

[6]Bekler H，Uygur AM，Gökçe A，et al. The effect of steroid use on the pathogenesis of avascular necrosis of the femoral head [J].Acta Orthop Traumatol Turc，2007，41(1)：58- 63.

[7]Okazaki S，Nishitani Y，Nagoya S，et al. Femoral head osteonecrosis can be caused by disruption of the systemic immune response via the toll-like receptor 4 signalling pathway [J].Rheumatology，2009，48(3)：227- 232.

[8]杨建平，王黎明，徐燕，等.单次低剂量脂多糖联合甲基强的松龙诱导股骨头坏死的实验研究[J].中国修复重建外科杂志，2008，22(3)：271- 275.

[9]童培建，毛强，吴承亮，等.大鼠激素性股骨头坏死组织氧化应激相关基因的差异表达[J].中华骨科杂志，2011，31(7)：794- 799.

[10]Ding S，Peng H，Fang HS，et al. Pulsed electromagnetic fields stimulation prevents steroid-induced osteonecrosis in rats [J].BMC Musculoskelet Disord，2011，12：215- 222.

[11]Effendy NM，Khamis MF，Shuid AN.Micro-CT assessments of potential anti-osteoporotic agents[J].Curr Drug Targets，2013，14(13)：1542- 1551.

[12]Calder JD，Buttery L，Reveu PA，et a1.Apoptosis-a significant cause of bone cell death in osteonecrosis of the femoral head [J].J Bone joint Surg，2004，86(8)：1209- 1213.

·论著·

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2015.02.004

Establishment and Assessment of Rat Models of Glucocorticoid-induced Osteonecrosis

DONG Yu-lei，ZHOU Lei，LI Yu-long，XIAO Ke，WENG Xi-sheng

Department of Orthopedics，PUMC Hospital，CAMS and PUMC，Beijing 100730，China

Corresponding author：WENG Xi-shengTel：010- 69152810，E-mail：xshweng@medmail.com.cn

ABSTRACT：ObjectiveTo establish the rat models of glucocorticoid-induced osteonecrosis and evaluate the osteonecrosis by high-resolution micro-CT and histomorphology.MethodsTotally 30 Sprague-Dawley male adult rats(age：12 weeks；body weight：400- 450 g)were randomized into two groups：one group received two doses of intraperitoneal injection of lipopolysaccharide(20 μg/kg)at an interval of 24 hours，24 hours later，the rats received three doses of intramuscular injection of methylprednisolone(40 mg/kg)at an interval of 24 hours；in the control group，the rats received same amount of normal saline.Four weeks later，5 rats in each group were sacrificed randomly.Eight weeks later，all the remaining rats were sacrificed and the femur specimens were scanned by micro-CT.The trabeculae parameters of the femoral head were calculated.The hematoxylin and eosin staining were performed to calculated the success rate.ResultsThe incidence of osteonecrosis was 80% in the experimental group.The micro-CT demonstrated broken and cystic degeneration.The quantitative analysis showed that the bone volume/total volume(experimental group：0.55±0.13vs. control group: 0.68±0.12;P<0.05)，bone surface area / bone volume(experimental group:20.45±5.13vs. control group: 24.00±5.20;P<0.05)，and trabeculae number(experimental group: 5.67±0.50vs. control group: 6.24±0.96;P<0.05)were significantly lower in experimental group than those in control group.ConclusionsA rat model of glucocorticoid-induced osteonecrosis was successfully established by lipopolysaccharide and methylpredniso- lone.High-resolution micro-CT is useful for the qualitative and quantitative analyses of the morphology and structure of trabeculae，showing good consistence with the histomorphological findings.

Key words：glucocorticoids；osteonecrosis；micro-CT

(收稿日期：2014- 12- 01)

中图分类号:R681.8

文献标志码:A

文章编号：1000- 503X(2015)02- 0152- 05

通信作者：翁习生电话：010- 69152810，电子邮件：xshweng@medmail.com.cn

基金项目：国家自然科学基金(81272009)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(81272009)

·论著·