虫草菌丝体HPLC指纹图谱的研究*

*基金项目：十二五重大新药创制专项 (2011ZX09201-201-30)；江西省高等学校科技落地计划项目(产学研合作KJLD13061)；江西中医药大学研究生创新专项资金项目(JZYC12A01)；江西省研究生创新专项资金项目(YC2013-S238)。

**第一作者：聂鹤云，男，助教。研究方向：中药新剂型与新技术。Tel: 0791-87118614，E-mail: nhy2006@126.com。

虫草菌丝体HPLC指纹图谱的研究*

*基金项目：十二五重大新药创制专项 (2011ZX09201-201-30)；江西省高等学校科技落地计划项目(产学研合作KJLD13061)；江西中医药大学研究生创新专项资金项目(JZYC12A01)；江西省研究生创新专项资金项目(YC2013-S238)。

**第一作者：聂鹤云，男，助教。研究方向：中药新剂型与新技术。Tel: 0791-87118614，E-mail: nhy2006@126.com。

★聂鹤云1**陈丽华1张清华1朱卫丰1杨明2管咏梅1***(1.江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室南昌 330004；2.江西济民可信金水宝制药有限公司南昌 330096)

摘要：目的：建立虫草菌丝体的HPLC指纹图谱方法，为质量控制提供一定参考依据。方法：以phenomenx.OOG-4435-EO-C18为色谱柱；流动相为甲醇-0.05%磷酸水梯度洗脱，检测波长为260nm，进样量为10μL，流速为1.0 mL/min；对指纹图谱进行相似度评价以及聚类分析。结果：建立虫草菌丝体的HPLC指纹图谱，确定9个共有峰；确定其相对保留时间以及相对峰面积的比值，该方法能够很好的鉴别不同生产厂家虫草菌丝体产品。结论：该方法精密度、稳定性和重复性良好，可应用于虫草菌丝体的质量控制。

关键词：虫草菌丝体；高效液相；指纹图谱；相似度

冬虫夏草(cordycepssinensis)，是麦角菌科真菌冬虫夏草寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体[1]，是一种传统的名贵滋补中药材，有调节免疫系统功能、抗肿瘤、抗疲劳等多种功效。近年来，由于自然环境及开采过度的影响，冬虫夏草的产量日益减少，无法满足市场的需要，价格居高不下，目前国内已采用以天然虫草真菌发酵法获得人工虫草菌，并且已经在临床上广泛使用。目前市售发酵虫草菌粉制剂有金水宝胶囊、百令胶囊、宁心宝胶囊、心肝宝胶囊以及至灵胶囊。这5种虫草菌丝产品中，质量标准载入2010版《中国药典》的仅有金水宝胶囊、金水宝片及百令胶囊。宁心宝胶囊、心肝宝胶囊、至灵胶囊收载于卫生部颁成方制剂标准中。百令胶囊检测项包括薄层色谱法检测麦角甾醇；高效液相色谱法测定腺苷类成分；金水宝片剂及金水宝胶囊剂检测项包括薄层色谱法鉴别腺嘌呤、腺苷、尿苷成分；高效液相色谱法测定腺苷含量。此类检测虽能对虫草菌丝类产品质量进行控制，但却难以区分类似产品。为了避免单一成分控制产品质量的不足[2]，本实验采用HPLC指纹图谱对虫草菌丝类产品进行研究，通过相似度评价，聚类分析较为全面地鉴别不同厂家虫草菌丝体。

1仪器与材料

1.1仪器 GZX-9140MBE型数显鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司)，Agilent1260型高效液相仪(美国安捷伦)，KQ3200E型超声波清洗器(昆明市超声仪器有限公司)。BT25S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

1.2材料 百令胶囊(杭州中美华东制药有限公司)，宁心宝胶囊(正大青春宝药业有限公司)，至灵胶囊(大同市利群药业有限责任公司)，心肝宝胶囊(长天药业)，金水宝胶囊(江西济民可信集团有限公司)，见表1。

尿苷对照品(中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，批号：1065-101017)，鸟苷对照品(中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，批号：1081-110401)，腺苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110879-200202)，染料木素(南昌贝塔生物科技有限公司,批号：10362-201211)，麦角甾醇(南昌贝塔生物科技有限公司，批号：20042-201202)，大豆素、黄豆黄素对照品自制，质量分数大于99%；乙腈色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。

表1　样品来源

2实验方法与结果

2.1供试品的制备精密称取金水宝、百令胶囊、至灵胶囊、宁心宝胶囊、心肝宝胶囊各1g,分别倒入锥形瓶中，加入甲醇20mL，超声30min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量,摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.2混合对照品溶液制备分别精密称取腺嘌呤、腺苷、尿苷、鸟苷、染料木素、大豆素、黄豆黄素、麦角甾醇5mg置于50mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度线，即得100μg/mL的混合对照液，再过0.22μm的微孔滤膜，取续滤液，备用。

2.3方法学考察

2.3.1色谱条件十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为phenomenx.OOG-4435-EO(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇(B)-0.05%磷酸水(A)，梯度洗脱：0～10min，5%B；10～20min，5%～30%B；20～60min，30%～100%B；60～70min，100%B； DAD检测器，体积流量为1.0 mL/min，进样量为10μL。

2.3.2精密度实验精密称取金水宝胶囊样品(130907)，按照2.1项下的方法的处理，在2.3.1项的色谱条件下进样，连续进样5次，结果表明共有峰相对保留时间RSD在0.34%～1.22%，共有峰相对峰面积>5%的峰面积值RSD在0.56%～1.45%，符合指纹图谱标准，精密度良好。

2.3.3重复性实验取同一批次的样品，按照2.1项下的方法制备6份供试品，在2.3.1项色谱条件下进样，记录色谱图，结果表明共有峰相对保留时间RSD在0.26%～1.08%，共有峰相对峰面积RSD在0.79%～1.88%，符合指纹图谱标准，重复性良好。

2.3.4稳定性试验取同一批次金水宝胶囊(130907)新制备的供试品于0、2、4、8、12、24h进样HPLC分析，结果表明共有峰相对保留时间RSD在0.45%～1.65%，共有峰相对峰面积RSD在0.62%～1.67%，符合指纹图谱标准，表明各成分在24h稳定。

图1　虫草菌丝体共有峰模式

2.4虫草菌丝体指纹图谱的确立[3-5]

2.4.1虫草菌丝体共有峰的确立按上述液相色谱条件测定了 15份虫草菌丝体药品(表1中的1～ 12号样品),采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统( 国家药典委员会，2004B版) 对12批次样品色谱图进行分析，确定了9个共有峰，共有峰保留时间分别为2.52、3.17、3.56、4.51、6.10、7.85、14.85、64.95、69.90min，结果见图1。选取9号峰位参照峰，计算虫草菌丝体其他共有峰相对保留时间、相对峰面积，结果见表 2、3。

表2　12批虫草菌丝体共有峰相对保留时间

表3　12批虫草菌丝体共有峰相对峰面积

2.4.2不同厂家虫草菌丝指纹图谱比较在相同的液相条件下分析5个不同产家12批虫草菌丝体产品,通过比较5种不同厂家的虫草菌丝体HPLC图谱，发现不同种类的虫草菌丝体化学成分有一定的差异，5种虫草菌丝体中除宁心宝胶囊不含4、8号峰外，其余的都含上述8种化学成分，此外金水宝胶囊、至灵胶囊、心肝宝胶囊还含大豆素、黄豆黄素、染料木素，而百灵胶囊、宁心宝胶囊未检测出这些成分，见图3。

2.5聚类分析以 12批不同生产厂家的虫草菌丝体为研究对象，进行指纹图谱研究，得到9个共有色谱峰，将至灵胶囊9号作为参比峰，其他色谱峰相对于至灵胶囊9号峰的峰面积量化，得到原始数据作为聚类分析的指标，采用SPSS统计软件进行分析，聚类分析图见图4。从图4可以看出S1、S2为一类，为百令胶囊，S3、S4为一类，为宁心宝胶囊，S5、S6、S7为一类，为至灵胶囊，S8、S9为一类，为心肝宝胶囊，S10、S11、S12为一类，为金水宝胶囊。这与实际情况相符合，说明该方法可以很好的鉴别不同种类的虫草菌丝体，可以作为一种虫草菌丝体质量控制的手段。

图2　虫草菌丝HPLC指纹图谱叠加图

图3　12批样品峰面积聚类分析图

3讨论

3.1不同提取方式得选择实验考察了冷凝回流提取、冷浸提取、超声波提取三种提取方式，结果发现超声提取化学成分多、操作简单方便、效率高、因此采用超声波提取供试品。

3.2不同提取溶剂测选择实验比较了水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、纯甲醇作为提取溶剂，结果表明甲醇作为提取溶剂、所得的峰多，且分离效果较好，因此选择甲醇作为提取溶剂。

3.3检测波长的选择本实验采用DAD检测器，对发酵虫草菌粉色谱图在200～400nm波长范围内全波长扫描，结果发现260nm，基线最平稳，且主要化学成分峰也最高，因此确定260nm作为检测波长。

3.4流动相的选择虫草菌丝类所含化学成分复杂，且各种类型的化合物的极性差别较大，考察了等梯度甲醇-水系统、乙腈-水系统、及甲醇-0.05%磷酸水系统、乙腈-0.05%磷酸水溶液梯度系统，结果发现，甲醇-0.05%磷酸水溶液梯度系统，基线最平稳，且分离较好，故选择甲醇-0.05%磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱。

3.5建立指纹图谱的意义本实验建立的虫草菌丝指纹图谱，能够使虫草菌丝体共有成分以及各虫草菌丝体特有成分在色谱图中体现，从而化学成分的角度反映不同生产厂家虫草菌丝整体化学信息，因此可作为一种鉴别不同厂家生产的虫草菌丝体方法，所建的指纹图谱具有良好的稳定性和可控性，因此也可以作为虫草菌丝产品内在质量控制的一种有效方法。

参考文献

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010:106.

[2]武彦舒，周丹蕾，鄢 丹,等. 天然虫草与虫草菌丝体的HPLC指纹图谱研究[J].中国中药，2008,33(19)：2 212-2 214.

[3]苏颖，李竞.人工蛹虫草HPLC指纹图谱的建立[J].亚太传统医药，2012, 8(3):10-11.

[4]祝明，金樟照，陈勇，等. 百令胶囊的指纹图谱鉴别研究[J].中成药，2007,29(9)：1 254-1 256.

[5]郝子博，王丽莉，张铁军. 落花生茎叶HPLC 指纹图谱研究[J].中草药，2012,43(10)：2 050-2 052.

HPLC Fingerprint Analysis of Mycelium of Cultured Cordy

NIE He-yun1,CHEN Li-hua1,ZHANG Qing-hua,ZHU Wei-feng1, YANG ming2, GUAN Yong-mei1

1.KeyLaboratoryforModernPreparationofTraditionalChineseMedicine,MinistryofEducation,JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China;

2.JiangxiJimingkexinJinshuibaoCo.Ltd,Nanchang330096,China.

Abstract:Objective：To establish HPLC fingerprints of mycelium of cuhured cordy for qualitycontrol.Method:HPLC method was used for the determination of phenomenx.OOG-4435-EO-C18column(250mm×4.6mm,5μm)and methanol-0.05%H3PO4in gradient ehtion as a mobile phase，the detection wavelength was 260nm，injection sample of 10μL and flow rate of 1.0mL/min；The similarity of fingerprints was evaluated，then，duster analysis was studied.Result: HPLC fingerprint of cordyceps Mycelial was established，nine common peaks were selected as the fingerprint peaks of cordyceps Mycelial；The relative retention time and the ranges of relative area of the common peaks were determined，cordyceps Mycelial from different production of producers and could be distinguished by the HPLC fingerprint.Conclusion:The method has desirable precision，reproducibility and stability，it can be applied to the quality control of cordyceps Mycelial.

Key words:Cordyceps Mycelial；HPLC；Fingerprint；Similarity

收稿日期：(2015-05-14)编辑：翟兴英

中图分类号：R284.1

文献标识码：B

通信作者：***管咏梅，女，副教授，硕士生导师。研究方向：中药新剂型与新技术。Tel:0791-87118614，E-mail: guanym2008@163.com。