毛尖蘑粗多糖对H22肝癌小鼠 TNF-α和IL-2表达的影响①

罗文哲 ，王建杰， 吕冬霞

(佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

毛尖蘑粗多糖对H22肝癌小鼠 TNF-α和IL-2表达的影响①

罗文哲 ，王建杰， 吕冬霞

(佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

目的：研究毛尖蘑粗多糖对H22肝癌小鼠 TNF-α和IL-2表达的影响。方法：建立小鼠肝癌模型，并随机分为4组：阴性对照组、阳性对照组、毛尖蘑粗多糖低(20mg/mL)、高剂量组(40mg/mL)，每组10只。于接种后24h给予不同处理，每日1次，腹腔注射。14d后，采用ELISA法测定血清中TNF-α与IL-2水平，RT-PCR对外周血单个核细胞(PBMC)TNF-α与IL-2 mRNA表达进行检测。结果:模型对照组血清中IL-2 水平低于正常对照组(P<0.05)，TNF-α水平变化不明显，毛尖蘑粗多糖组TNF-α和IL-2水平高于模型对照组(P<0.05)。PBMC中TNF-α和IL-2mRNA在毛尖蘑粗多糖组高于模型对照组(P<0.05)。结论：毛尖蘑粗多糖能促进TNF-α和IL-2 分泌而发挥了抗肿瘤作用。

毛尖蘑粗多糖；肝癌；细胞因子

毛尖蘑，别名金子蘑，是一种罕见的野生珍稀食用真菌。在前期研究工作中，我们对毛尖蘑中的粗多糖进行了提取，并发现其对H22荷瘤小鼠的肿瘤生长有抑制作用[1,2]，但对免疫功能的影响尚未见报道。因此，本研究通过建立小鼠H22肝癌模型，采用ELISA、RT-PCR方法，对荷瘤小鼠外周血中TNF-α与IL-2水平、以及相应的mRNA进行了检测，以阐明毛尖蘑粗多糖如何影响H22肝癌小鼠的免疫功能，为毛尖蘑粗多糖的抗肿瘤作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

毛尖蘑子实体购于大兴安岭呼玛县韩家园林业局松涛鹿苑公司。环磷酰胺(CTX)为上海华氏制药有限公司天平制药厂产品。红细胞裂解液、淋巴细胞分离液购于上海新睿生物科技有限公司。TNF-α、IL-2酶联免疫双抗体夹心(ELISA)试剂盒购于深圳赛保尔生物药业有限公司。总RNA提取试剂盒、反转录cDNA合成试剂盒购于Promega生物公司。Trizol试剂购于Invitrogen公司。β-actin多克隆抗体来自北京北京康为世纪生物科技有限公司。昆明种小鼠雌性为佳木斯大学实验动物中心提供。小鼠H22肝癌细胞株为哈尔滨医科大学肿瘤研究所惠赠。

1.2 方法

1.2.1 毛尖蘑粗多糖提取

根据文献报道，采用热水浸提方法改良[1]。

1.2.2 建立小鼠肝癌模型以及药物处理

将小鼠腹水瘤以生理盐水制成肿瘤细胞悬液，浓度5×106个/mL，注于小鼠右前肢腋下0.2mL/只，制作荷瘤鼠模型，共40只。24h后，将小鼠随机分成4组，每组以不同的处理因素进行干预，一组为肿瘤对照组(对照组)：无任何干预；一组为阳性药物对照组(CTX组)：给予CTX，25mg/kg·d，每日1次，腹腔注射；其他两组为毛尖蘑粗多糖低剂量、高剂量组：低剂量组给予毛尖蘑粗多糖20mg/mL，高剂量给予40mg/mL，腹腔注射，每日1次，连续14d。每日观察，隔日称重。

1.2.3 检测荷瘤小鼠血清TNF-α、IL-2的水平

各组小鼠14d后，外周血采血，4 ℃、3,000r/min离心10min，吸取血清，ELISA法检测各组小鼠血清中TNF-α和IL-2的水平，实验步骤按试剂盒说明书操作。

1.2.4RT-PCR检测TNF-α、IL-2mRNA的表达

应用淋巴细胞分离液分离小鼠的外周血中的PBMC，调整细胞浓度至2×106个细胞/mL，于24孔细胞培养板中各加0.5mL的细胞悬液，在培养箱中(5%CO2、37 ℃)培养48h。加入Trizol，按照说明书提取细胞的总RNA。应用一步法反转录试剂盒转录，PCR扩增，25μL为总反应体积。TNF-α引物序列(460bp)：上游：5’-TGGCCCAGACCCTCACA-3’，下游：5’-TGCCCGGACTCCGTGAT-3’；IL-2引物序列(502bp)：上游: 5`-ATGTACAGCATGCAGCTCGCATC-3`，下游: 5`-GGCTTGTTGAGATGATGCTTTGACA-3`；β-actin序列：上游: 5`-ATGGGTCAGAAGGACTCCTATGTGG-3`，下游: 5`-CGCCTAGAAGCACTTGCGGTG-3`。TNF-α的反应条件为94 ℃变性30s，55 ℃退火30s, 72 ℃延伸30s，共30个循环，72 ℃延伸5min。4 ℃终止。IL-2的反应条件为94 ℃变性30s，57 ℃退火45s，72 ℃延伸30s，共30个循环，72 ℃延伸7min。4 ℃终止。内参为β-actin。应用图像灰度扫描系统进行灰度值测定，计算与β-actin比值，得到mRNA相对含量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 毛尖蘑粗多糖的提取

用苯酚-硫酸法测定了毛尖蘑子实体中提取的固形物中多糖的含量为97.5%。

2.2 血清中IL-2 和 TNF-α的变化

IL-2 水平在模型组低于正常组(P<0.05)，TNF-α无明显变化，毛尖蘑粗多糖组IL-2 和TNF-α较模型组明显增加(P<0.05)。

表1 毛尖蘑粗多糖对小鼠血清IL-2和TNF-α水平的影响

注：与模型比较，*P<0.05；与正常组比较，#P<0.05。

2.3 TNF-α 和IL-2 mRNA的表达

如表2、图1显示，IL-2、TNF-α的PCR结果在502bp和460bp处出现条带，条带灰度值经扫描分析，差异具有显著性(P<0.01)。

图1PBMC中IL-2、TNF-αmRNA表达

表2 毛尖蘑粗多糖对PBMC IL-2、TNF-αmRNA表达的影响

注：与模型对照组比较，**P<0.01

3 讨论

研究显示，TNF-α与IL-2是免疫系统中起重要作用的调节因子，调节T、B细胞的增殖、分化等免疫功能，并参与各种免疫反应以及炎症反应。肿瘤免疫中，TNF-α与IL-2二者协同发挥抗肿瘤作用[3]。经过炎症介质、内毒素、白细胞介素-1等物质的刺激，单核/巨噬细胞活化，活化后主要分泌肿瘤坏死因子，它是一种小分子蛋白质。根据不同的基因结构及功能, 肿瘤坏死因子分为TNF-α、TNF-β两种。单核/巨噬细胞主要分泌的是TNF-α, 而TNF-β主要由活化的T淋巴细胞产生。TNF-α具有直接的抗肿瘤作用，以自分泌的方式作用于分泌的细胞，在病变部位产生，并集中于局部区域，具有选择性，被认为是一种多功能的细胞因子[4]。IL-2为T细胞生长因子，对T细胞的活化、增殖具有促进作用，是重要的可溶性因子，也是细胞因子网络性调节的核心，对细胞免疫、体液免疫以及非特异性免疫功能具有重要意义。目前，国内外文献报道显示, 晚期肿瘤患者或者荷瘤动物体内IL-2产生的含量明显比正常人低，同时，IL-2 活性也明显低于正常人, 这可能是癌症晚期患者或者荷瘤动物诱生了某些抑制性的细胞群，这些细胞群产生了免疫抑制因子，非特异性抑制了IL-2产生与活性，或者因为IL-1等这些IL-2生成必需的淋巴因子活性减弱引起[5]。 毛尖蘑是黑龙江省特有的食、药用真菌，天然绿色食品。其多糖具有抗肿瘤，保肝护肝，增强免疫力等作用[2]。对此，我们进一步研究了毛尖蘑粗多糖组对TNF-α和IL-2的影响，经过实验证明，荷瘤小鼠在灌胃2周后，TNF-α和IL-2水平明显升高，mRNA表达增强。由此，我们可以认为，毛尖蘑粗多糖促进免疫细胞分泌TNF-α和IL-2，这是通过促进了外周血单个核细胞的TNF-α和IL-2mRNA的转录。毛尖蘑粗多糖能通过调节TNF-α和IL-2分泌发挥了抗肿瘤作用。

[1]范晓艳，吕冬霞，刘爽，等. 毛尖蘑粗多糖提取方法的研究[J].黑龙江医药科学,2010，33(4): 20-21

[2]吕冬霞,范晓艳,金岳雷,等. 毛尖蘑子实体粗多糖对H22荷瘤小鼠的抑瘤作用[J].中国老年学杂志,2012,32(11):2303-2304

[3]MargolinKA.Interleukin-2inthetreatmentofrenalcancer[J]．SeminOncol，2000，27(2):194-203

[4]孙云晖,代立娟. 肺癌中PPAR-和TNF-的表达及临床意义[J].黑龙江医药科学,2008,31(1):12-13

[5]王丽娟,孙蕾,王振东.葛根素对U14宫颈癌小鼠免疫和氧化功能的影响[J].黑龙江医药科学,2011,34(4):42-43

佳木斯大学校级重点项目，编号：Sz2013-002。

罗文哲(1976～)男，黑龙江佳木斯人，在读硕士研究生，副教授。

吕冬霞(1965～)女，黑龙江佳木斯人，博士，教授，硕士研究生导师。E-mail: luo228071luo@163.com

R737.9

A

1008-0104(2015)04-0037-02

2014-12-22)