水通道蛋白分子成像研究

林艳红，孙夕林，程雁，吴泳仪，申宝忠

水孔通道蛋白（aquaporin，AQPs）又称水通道蛋白，是一组高度保守的跨膜转运蛋白，以四聚体的形式富集于细胞膜，对水具有高度选择通透性。水通道蛋白由Peter Agre在1993年首先发现，其功能的发现彻底改变了传统的关于水分子在细胞膜上自由扩散的理念[1，2]。目前，哺乳动物体内至少发现13种高度同源的水通道蛋白亚型（AQP0-AQP12），其中，水甘油通道蛋白（AQP3，7，9，10）除可以转运水分子外也可转运某些小的中性溶质分子如甘油、尿素等。研究证实水通道蛋白广泛分于全身各组织器官，介导着不同类型细胞膜上水和小分子物质的跨膜转运，对维持体内渗透压及内稳态的平衡具有十分重要的生理意义。近年来，随着对AQPs研究的不断深入，在某些病理情况下，如心血管系统疾病、神经系统退行性疾病、肿瘤的血管生成和细胞迁移等，AQPs分布和表达也发生了改变[3]。因此，水通道蛋白已经成为许多疾病重要的治疗靶点，对其功能的调控具有十分重要的治疗意义。目前，亟需研发一种在体、实时、定量的AQPs检测方法，快速准确的检测出活体组织细胞中AQPs的表达及分布。分子成像可在活体状态下实现细胞和分子水平生物学过程的可视化，并可进行定性和定量分析，将复杂的生物过程转换成直观图像，实现关键分子靶点的在体、实时动态成像，有助于推动AQPs基础研究向临床应用的转化。

分子影像学在AQPs检测中的应用

近年来，随着分子生物学和分子医学的发展，疾病的研究进入到分子时代，分子影像学应运而生。分子影像学是指在活体状态下，在细胞和分子水平上应用影像学方法对人或动物体内的生物学过程进行成像，进而开展定性和定量研究的一门学科，具有无创、活体、实时动态、高特异性、高灵敏度等优点[4]。研究表明分子影像已成功实现EGFR、VEGFR、HIF-1α、OSP-1等肿瘤关键分子靶点的在体、实时动态可视化及精确定量分析[5-8]。目前，主要分子成像方法包括MRI分子成像、光学分子成像、超声分子成像以及核医学等成像方法。其中，MRI、PET成像技术对于AQPs成像具有广阔的发展潜力。

1.MRI-DWI在AQPs分子成像中应用

扩散加权成像（diffusion-weighted imaging，DWI）通过检测人体组织中水分子扩散运动受限的方向和程度，间接反映组织微观结构的变化，是从细胞及分子水平研究疾病病理生理状态的一种技术，已广泛应用于临床。

传统DWI成像原理：布朗运动即组织中水分子的不规则随机运动，是DWI的成像基础。纯水中的水分子扩散运动充分自由，而在活体组织中，生物膜及液体中的大分子将限制水分子的自由运动，当水分子所处组织结构和分子环境不同时，水分子扩散程度及信号衰减也不同，DWI则通过检测组织内水分子的扩散状态来反映组织结构的特点以及发现病变[9]。

一般来说，DWI对组织及细胞内水分子扩散运动的敏感程度用b值表示，b值为扩散敏感度，其反映施加的梯度脉冲强度和持续时间，b值越高，对水分子扩散运动越敏感，组织信号衰减越明显。常规的扩散加权成像假设人体组织是单一均匀物质，水分子随机运动造成的组织扩散加权信号的衰减程度随着b值的增加呈单指数衰减。然而，活体组织中水分子的扩散运动既有细胞内、外和跨细胞运动，同时也存微循环（灌注），在毛细血管中，水分子除了做布朗运动外，还随着血液流动，其内的水分子运动与毛细血管网的结构及血流速度密切相关。因此，在实际情况下单指数模型的假设无法反映真实的组织成分和结构变化。随着生物组织扩散研究的不断优化，Le Bihan等[10]在1986年首次提出了基于IVIM双指数模型。该模型同时考虑到体素内存在的分子扩散和血液微循环，认为组织扩散由两部分组成，即快速扩散质子池（细胞外扩散、血管内水分子、灌注）和慢速扩散质子池（细胞内扩散、血管外水分子），通过采集多个b值将水分子扩散与血液灌注分离，相对单指数模型而言可更好地反映生物组织DWI信息。

AQPs的发现——传统水单纯扩散理念的更新：传统的扩散加权成像无论是单指数模型还是双指数模型，均认为水分子的跨膜转运是通过自由扩散进行的。直至1993年，Agre发现水通道蛋白，提出水分子的跨膜转运除了自由扩散外，还可以通过水通道蛋白进行。而且进一步研究也验证了AQP的存在并明确了水分子在组织间自由扩散速度为（1～2）×10-3mm2／s，在AQP跨膜主动转运过程中扩散速度为0.45×10-3mm2／s。由此可见，水分子在细胞膜上通过AQPs的转运速度明显低于其细胞间隙自由扩散速度。因此，鉴于水分子跨膜转运的实际运动情况，要利用影像技术获得经AQPs转运水分子的扩散信息，更为可靠的方法是在双指数模型的基础上，引入更多、更高b值来提高对细胞膜上由AQPs转运导致扩散运动极度受限水分子的检测能力。eDWI分子成像即多b值多维度分析的增强版扩散成像（enhance DWI，eDWI），在扩散加权成像过程中通过采用连续、多个不同梯度的b值（包括低b值b＜200s／mm2、中b值300～1700s／mm2及高b值b＞1700s／mm2），获得反映水分子在组织细胞中不同扩散运动的分子谱。更为有趣的是水分子转运速率单位（mm2／s）与b值单位（s／mm2）呈倒数关系，将水分子经由AQPs转运的速度值0.45×10-3mm2／s取倒数后（约为2222），恰好符合eDWI高b值范围（＞1700）。因此，近年来研究认为b值越高，eDWI成像检测的对象越接近AQPs内转运的水分子，而高b值条件下的eDWI就能够利用这一原理特异性的对细胞膜上的AQPs的表达情况进行定量评价[11，12]。

AQPs的eDWI分子成像：李佳慧等[13]采用18个（0～4500）b值，选择水、对比剂、全血、血浆和红细胞等不同组织，并用乙酰唑胺作为红细胞膜水通道蛋白抑制剂进行DWI多b值分子成像。实验结果表明，低b值（0～200）时能够区分不同组织，具有较高的组织特异性；高b值（＞1700）时纯水和血浆信号基本可以忽略，获得的水分子扩散的信息主要来自于经水通道蛋白的转运，从而获得AQPs在细胞膜表达及分布信息。在此基础之上，李秋菊等[14]进行大鼠肝脏纤维化模型中AQPs的DWI多b值分子成像，研究表明与传统DWI相比，高b值可以检测早期肝脏纤维化中的变化。肝脏纤维化早期AQP1呈明显高表达，加入抑制剂乙酰唑胺后，高b值下AQP1的表达与表观扩散系数呈明显的相关性，为肝脏纤维化诊断及分期提供了新的途径。

2.PET在AQPs分子成像中的应用

正电子发射断层扫描（positron emission tomography，PET），可在分子水平上洞察人体功能代谢、基因及蛋白表达状态，并进行定量，是目前分子影像最主要的成像方法之一[15]。PET分子成像的关键是能够特异性识别分子靶点的靶向分子成像探针的构建，分子成像探针的设计通常是通过修饰和标记靶点的特异性配体、抑制剂、拮抗剂、激动剂、底物以及酶类。

放射性核素标记AQPs特异性结合配体的分子成像：关于水通道蛋白，分子成像探针的设计构建之一就是用放射性核素标记的水分子以及甘油（水甘油通道蛋白），然而，由于水对于AQPs亚型并没有特异性，使其较难广泛应用于PET研究。目前，研究表明通过放射性核素标记甘油可以用来构建水甘油通道的分子成像探针。Yuriko Saito等[16]用14C-甘油作为分子成像探针并分别在agAQPs不同表达水平的肿瘤细胞及相应鼠移植瘤模型中进行该探针的放射性分布研究。细胞水平研究表明agAQPs的表达水平与14C-甘油的摄取呈正相关，与agAQPs低表达的肿瘤细胞相比，agAQPs过表达肿瘤细胞对甘油的摄取量明显增加，加入特异性抑制剂后，甘油的摄取以剂量依赖的方式降低；与离体实验结果相反，荷瘤鼠的在体研究结果表明不同agAQPs表达水平的肿瘤中14C-甘油的摄取并没有显著不同，但值得注意的是agAQPs高表达肿瘤中放射性活性与血浆相似，均以时间依赖的方式进行衰减，而agAQPs低表达肿瘤的放射性则保持恒定。研究表明14C-甘油构建的分子成像探针可以用来评估agAQPs的表达水平，对于特异性靶向agAQPs的分子成像有潜在应用价值。

放射性核素标记AQPs特异性抑制剂的分子成像：另外一种AQPs分子探针的设计方案为利用放射性核素标记其小分子特异性抑制剂。Yukihiro等[17]利用放射性核素11C标记AQP4的特异性抑制剂TGN-020，合成了靶向AQP4的分子成像探针[11C]TGN-020，利用该探针分别对AQP4野生型和AQP4空白鼠进行PET成像，实验结果显示与空白组小鼠相比，野生型小鼠对该探针呈明显的整体的高摄取，与以前报道的AQP4在肌肉和骨骼肌中选择性分布相一致；另外，两组老鼠的心脏对[11C]TGN-020均呈明显高摄取，这可能是由于[11C]TGN-020对AQP1也有一定的亲和力，文献报道AQP1与AQP4有大约60%的同源性（图1）。同时，该研究小组对[11C]TGN-020在脑组织中的摄取情况进行了离体验证，将小鼠杀死后取脑组织再次进行PET成像，WT组小鼠的脑组织对[11C]TGN-020有明显的高摄取，KO组小鼠的脑组织呈较低摄取（图2）。

随后，该研究小组首次进行了[11C]TGN-020在健康人体的PET成像研究[18]，图像后处理后得到显示颅内放射性配体分布的图像，图像显示在软脑膜及血管周围的星形胶质终足细胞以及脉络丛部位有明显的[11C]TGN-020浓聚，这与已经报道的AQP4在颅内的分布一致（图3）。

以上研究结果表明，[11C]TGN-020可以特异性的与AQP4靶向结合，是放射性标记AQPs特异性抑制剂的首次应用，为AQPs的在体分子成像研究奠定了基础。虽然TGN-020对AQP1一定的亲和力，但考虑到AQP4在脑部的分布特异性，其仍可以作为AQP4PET成像的特异性探针，提供AQP4表达及分布的定量数据，并对某些与AQP4相关疾病的严重程度进行分析。

AQPs分子成像面临的挑战与展望

在AQPs离体研究的基础上，利用分子影像技术可在体揭示AQPs在疾病发生过程中的表达与分布变化并进行定量分析，同时，由于AQPs特殊的结构与功能作用方式，使AQPs的分子成像希望与挑战并存。

1.eDWI开启AQPs分子成像全新途径及面临的挑战

图1 [11 C]TGN-020鼠在体PET成像。a）AQP4WT鼠；b）AQP4KO鼠[17]。

图2 [11 C]TGN-020离体鼠脑组织的PET成像。a）WT鼠；b）KO鼠[17]。

图3 [11 C]TGN-020健康人脑组织在体PET成像[18]。

研究表明eDWI多b值扩散加权成像可以在体、实时、动态的进行AQPs分子成像，有利于推动AQPs基础研究向临床应用的转化，开启了AQPs分子成像的全新途径，具有广阔的发展前景。但目前关于AQPs eDWI分子成像研究仍相对较少，且多处于离体水平，需要进一步开展更多的在体及相关临床应用研究；同时，要实现AQPs的精确定量仍存在一些挑战，如随着b值的增高，DWI图像信噪比降低、易发生变形和失真，同时，由于连续多b值扫描，获得图像数据量大，数据后处理复杂等[12]。针对以上挑战，可从以下几个方面提高MR设备性能及扫描技术，如增加磁场的均匀性、空间线性和保真度，配置更高密度的靶线圈及增大扫描视野等，此外，高性能的专用图像后处理系统及质量控制软件也是实现AQPs精确定量分析的重要基础工具。

2.靶向分子成像探针的构建是实现AQPs分子成像的关键

AQPs特异性抑制剂的研发是构建高亲和性、高靶向性分子成像探针的重要前提，由于小分子特异性抑制剂筛选方法的不足以及AQPs亚型之间的高度同源性，AQPs特异性抑制剂仍处于研究阶段。目前，AQPs的抑制剂主要包括离子类抑制剂、小分子有机化合物类抑制剂以及多肽类抑制剂。离子类抑制剂[19-21]，如Hg＋、Ag＋、Au3＋等金属离子以及四乙胺等非金属离子，可与胞外段特定的结构域相互作用，形成空间位阻，封闭水孔通道。但该类抑制剂的亚型特异性较小且具有一定的毒性，一定程度上限制其临床应用。近年来，乙酰唑胺、布美他尼及其衍生物（AqB013）、TGN-020（2-甲酰氨基-1，3，4-噻二唑）等小分子类抑制剂的研究越来越受到研究者的重视，是目前研究较为广泛的一类AQPs抑制剂。研究表明乙酰唑胺[22，23]是最早提出来的AQPs抑制剂，尽管对其抑制作用仍存在争议，但目前研究学者认为其主要抑制AQP1的活性，且已有研究进行了11C标记甲基乙酰唑胺的初步合成。TGN-020[17，18，24]在体外和体内试验中均可以明显抑制AQP4的转运活性，并成功进行了放射性标记其类似物的PET成像。布美他尼及其衍生物（AqB013）等[25]袢利尿剂具有AQP1和AQP4抑制活性，其中，AqB013对AQPs的抑制作用更加明显，有望成为AQPs选择性抑制剂化学合成基础。多肽类抑制剂被认为是特异性最高的一类抑制剂[26，27]。研究发现单克隆抗体aquaporumab可以与AQP4-IgG自身抗体竞争特异性结合AQP4，抑制AQP4介导的水分子转运。随着AQPs抑制剂作用机制及AQPs分子结构研究的不断深入，以高亲和性、高靶向性抑制剂为前体构建的分子成像探针有望实现AQPs的分子成像。

3.多模态成像体系引领AQPs分子成像未来发展趋势

近年来，随着分子影像技术的迅速发展，研究者们尝试将PET与常规的影像学技术相结合，如PET／CT、PET／MR，逐步形成了多模态成像体系，一次成像可同时得到感兴趣区生理功能信息及解剖结构信息是分子影像学近年来最大的进步，同时也代表了分子影像学的发展方向。目前，PET／CT已广泛应用于临床，并取得较大的临床效果；与此同时，PET／MR也逐步完成向临床应用转化[28]。与PET／CT相比，PET／MR避免了CT带来的放射性损伤，并提高了软组织分辨率。值得注意的是，PET／MR可实现PET提供的定量信息与MR特有的功能性磁共振成像（fMRI）序列，如eDWI、DCE和MRS等特定功能序列同步采集，即一次扫描可同时获得反应组织代谢的PET信息和反应组织解剖结构与功能的MR信息，保证了感兴趣区时间和空间位移上的一致性，将两种信息同步融合后分析，可进行精确定量，实现了真正意义上的优势互补。研究表明利用PET／MR同步采集特性，可进行一定脑功能的实时监测研究[29]。针对AQPs水分子转运功能的实时性与动态性，通过PET／MR可实现其在体、实时动态、精确定量成像，在多角度、多维度及多层次精细反映AQPs分布及表达状态，实现了APQs真正意义上的结构、功能与分子一体化成像，为AQPs的分子成像开辟了一条全新的途径，同时，多模态分子成像体系也是未来AQPs分子影像研究的发展趋势。

综上所述，AQPs是许多疾病发生发展进程中的关键分子靶点，分子影像学是多学科交叉领域。随着AQPs特异性抑制剂以及影像设备的不断发展，分子成像技术可实现对AQPs表达水平及分布状态在体、实时、动态成像，为临床筛选分子靶向治疗优势人群、疗效检测提供可靠依据，使AQPs分子成像的临床转化成为可能。

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