狂犬病病毒核酸诊断技术研究进展

路 静综述，伊正君，付玉荣审校

0 引 言

狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus，RABV)引起的人兽共患烈性传染病，发病后死亡率几乎为100%。全世界每年约有5.5万人死于狂犬病 ，狂犬病发生于世界上的80多个国家和地区，包括发达国家和发展中国家［1-2］。根据WHO发布的报告，2010年全球因狂犬病死亡人数约为61000人，中国经临床确诊的狂犬病人数约为3300人［3］。近年来随着猫、犬等宠物的增加，该病发病率逐年上升［4］。

随着分子生物学技术的迅速发展，基于病毒基因组的核酸诊断技术广泛应用于狂犬病的诊断中［5］。RABV的核酸诊断技术主要扩增N基因，在RABV的进化中L基因的部分核苷酸区域保守性强，也可作为检测目标。目前应用于RABV的核酸诊断技术主要有基于PCR方法的核酸诊断技术(polymerase chain reaction，PCR)、依赖核酸序列扩增技术(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)、环介等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification techniques，LAMP)、基因芯片技术，现从这些方面为RABV的核酸诊断技术作一综述。

1 RABV的基因组结构

RABV属于单股负链RNA病毒目、弹状病毒科、狂犬病毒属，是具有包膜的单股负链RNA病毒，在电子显微镜下呈弹状或管状，长170～180nm，直径75～80nm。RABV基因组由11928-11932个核苷酸组成，相对分子质量为4.6×106，包括3'端的先导区、5个连续的结构基因和5'端的非翻译区7个部分。位于3'端的先导RNA基因即Leader结构由58个核苷酸构成，富含残基A。5个结构基因从3'端到5'端的排列顺序是 N、P、M、G、L，分别编码核蛋白、衣壳基质蛋白、膜基质蛋白、糖蛋白、逆转录酶。5'端的非翻译区即Trailer结构由56个核苷酸组成，富含T碱基。各结构基因之间含有核苷酸数目不等的非转录间隔区，N-P、P-M、M-G和G-L之间的非转录间隔区分别含有核苷酸2个、5个、5个和24-29个，其中G基因和L基因之间是具有423个核苷酸的伪基因ψ，为RABV的非编码区。

N基因由1 424个核苷酸组成，起始于第58位核苷酸，终止于第1 482位核苷酸，编码一个长度为1 353个核苷酸的开放阅读框(open reading frame，ORF)。碱基 A、T、G和 C所占比例分别为 28.68%、26.98%、23.80% 和 20.55%。N 基因是RABV中序列最保守、最稳定的结构基因，其内部有2个高度保守的区域，分别位于第64-105位氨基酸和第201-329位氨基酸，后者又可分为2个更为保守的区域，即第210-242位氨基酸和第271-317位氨基酸。N基因编码的核蛋白表达量最高，常用作病毒的分型与诊断。根据N基因99位-405位和1 080位-1 278位核苷酸间的序列差异，RABV分成7个基因型，我国流行的RABV均为基因1型。P基因共有991个核苷酸，ORF含有核苷酸894个。M基因共有804或805个核苷酸，ORF含有核苷酸609个。G基因共有1675个核苷酸，ORF含有核苷酸1575个。L基因共有6475或6476个核苷酸，ORF含有核苷酸6429个。

2 RABV的核酸诊断技术

2.1 基于 PCR方法的核酸诊断技术 该方法1991年首次用于RABV的实验室诊断，是世界卫生组织(World Health Organization，WHO)和世界动物卫生组织(Office International Des Epizooties，OIE)推荐的标准方法。主要以RABV保守且特异的N基因为扩增目标，包括反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)，巢式和半巢式反转录聚合酶链反应(nested reverse transcription polymerase chain reaction and hemi-nestedreverse transcription polymerase chain reaction，nRT-PCR and hnRT-PCR)，荧光定量反转录聚合酶链反应(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR)，PCR酶联免疫吸附试验(PCR-enzyme-linked immunosorbentassay，PCRELISA)等［6-8］。

2.1.1 RT-PCR 该方法用时短，整个过程约为6～8 h。可检测的样本范围十分广泛，除普通标本外，病毒载量低的样本如疑似狂犬病患者死亡前的唾液、脑脊液、皮肤活检样本均可用RT-PCR，尤其是不适宜病毒分离和组织学检测的腐败样本均能用该方法检测，而且结果直观，易于观察，因此广泛应用于狂犬病的诊断［6-9］。该方法可以扩增N基因和分析核苷酸序列，所以也可用于狂犬病的分子流行病学调查。

目前WHO和OIE尚未推出RT-PCR法诊断狂犬病的标准操作规程［9］。由于操作程序缺乏规范性，实验室容易出现交叉污染或假阴性问题，检测缺乏可靠性，因此限制了其在人和动物狂犬病日常诊断中的应用［10］。但是 Aravindh Babu RP 等［9］用RT-PCR方法扩增部分N基因，检测了患有狂犬病的猫、牛、犬、鼠和人等动物的死后脑组织样本。试验共设计了3对引物，其中第1对引物针对N基因的第154-174位和第660-641位核苷酸，扩增片段为506 bp，第2对针对N基因第410-429位和第942-923位核苷酸，扩增片段为533bp，第3对针对N基因第55-73位和第660-641位核苷酸，扩增片段为600 bp。将3种不同的引物组合，评价RTPCR快速检测感染狂犬病的动物脑组织的特异性和敏感性，检测结果与FAT的相符度为100%。该试验证实当标本不适宜FAT法检测或FAT检测结果不可靠时，RT-PCR可作为确认试验。在专业实验室和专业技术人员的操作下，通过严格的质量控制，RT-PCR方法同FAT联合使用可用于日常诊断。RT-PCR方法能够实现对高通量样品的快速检测，因此该方法依然能够得到广泛应用。

Biswal等［8］针对 N基因的第 319-337位和第823-842位核苷酸设计引物，目标扩增片段长度为523 bp，用RT-PCR方法分析了临床疑似狂犬病感染者的样本，具体包括死前患者的皮肤活组织样本、角膜印片和唾液以及死后患者的脑组织和脑脊液样本，并与传统的直接免疫荧光试验(direct immunofluorescence，DIF)、内基小体检查法、小鼠颅内接种分离法(mouse inoculation test，MIT)做比较，结果表明同MIT法相比，RT-PCR法检测RABV的灵敏度和特异性为100%。DIF法为83.3%，内基小体检查法为66.7%，证实RT-PCR法有较高的灵敏度和特异性，而且检测用时短，可用于死前诊断。RT-PCR法也可作为MIT确诊狂犬病的替代试验。

2.1.2 巢式和半巢式反转录聚合酶链反应Heaton等［11］于1997年首次用hnRT-PCR检测了6种RABV和狂犬病相关病毒。目前几种nRT-PCR和hnRT-PCR已被应用于临床样本RABV的RNA的检测，其检测结果可进一步用于序列鉴定及系统进化分析［8，12］。研究证实应用二次 PCR可提高检测狂犬病毒的能力［13］。Araújo 等［14］用 hnRT-PCR和RT-PCR分别检测了50例来自不同动物的解冻后脑组织标本，标本保存于-20℃，动物经DFA和MIT诊断为狂犬病感染。RT-PCR扩增片段为455 bp，hnRT-PCR扩增片段为299 bp。结果显示hnRTPCR的敏感性为90%，RT-PCR的敏感性为52%，从而证实前者敏感性显著高于后者。同传统的病毒分离方法RABV组织培养(rabies tissue culture infection test，RTCIT)和MIT相比，hnRT-PCR的敏感性显著提高，接近于 qRT-PCR［15］。Coertse 等［12］用hnRT-PCR法检测印度几种不同临床样本中RABV的RNA。他们首先分别针对N基因的第541-561位和第647-666位核苷酸设计引物进行第一步反应，反转录得到cDNA后利用针对N基因的第1-15位和第647-666位核苷酸设计的引物进行普通PCR反应。该试验证实hnRT-PCR的准确性和敏感性均较高，可用于敏感性要求高但又不具备qRTPCR条件的实验室。

2.1.3qRT-PCR qRT-PCR 是 WHO 和 OIE 推荐的检测RABV的标准方法，它可以对病毒进行定量测定，用以分析病毒载量、疾病进程、实验性治疗的有效性，在细胞培养系统中活毒的滴定、实验小鼠体内疫苗效价的测定、病毒致病机理研究以及病毒在实验动物体内分布的分析中发挥着重要作用［16］。

qRT-PCR可检测的标本范围十分广泛，目前qRT-PCR已广泛应用于狂犬病的诊断［17］。封闭式的反应管减少了交叉污染，敏感度比传统nRT-PCR高出10 ～1000 倍［18］。Mani RS 等［19］近期研究证实TaqMan qRT-PCR利用Taq Man荧光探针，通过内在的杂交反应，保证了其高度特异性。他们分别针对N基因正义链的第55-73位核苷酸和反义链的第(-165)位-(-146)位核苷酸设计引物，针对N基因第78-111位核苷酸设计探针，用其检测死后患者和死前患者的狂犬病毒RNA，前者为印度地区1997-2011年18例已死亡患者，患者经荧光抗体试验、内基小体试验、免疫组化试验确认为狂犬病患者，后者为在2011-2012年13例由生前实验室确认的死前狂犬病患者。这些患者的CSF样本阳性率为45.4%，颈部皮肤活检样本阳性率为60%，唾液样本阳性率为85.7%。CSF标本结合中和抗体检查，死前样本的阳性率为100%。Wacharapluesadee等［20］利用Taq Man qRT-PCR检测非神经样本中的狂犬病病毒RNA，特异性为100% 。Hayman等［17］在PCR反应体系中加入SYBR Green染料，用qRT-PCR的通用引物［针对N基因正义链第55-73位和反义链第(-165)位-(-146)位核苷酸设计］检测出了欧洲蝙蝠狂犬病病毒1型、2型和RABV，单一的通用引物即可以极高的敏感度检测出不同的RABV，从而使检测7种型别的RABV的RNA成为可能。Wang等［21］将 SYBR Green I染料加入 RTPCR反应体中，建立了SYBR Green I定量实时荧光RT-PCR方法。该方法利用了3条引物，其中1条针对RABV的Leader序列设计，用以扩增整个病毒的基因组。其他2条是针对N基因的保守区域设计的一对引物，用以扩增N基因。这种实时荧光RTPCR方法可对犬脑组织标本进行快速定量分析，提高了检测的特异性。高志强等［22］利用TaqMan方法，针对古典RABV非编码区及N基因编码区序列，设计合成多对引物和多条探针，建立了古典RABV荧光RT-PCR检测技术。与病毒分离鉴定、常规RT-PCR试验比较表明，该方法特异、敏感、快速，适用于感染动物不同组织中病毒的相对定量及疫苗中活病毒或灭活病毒的检测。应用qRT-PCR检测技术检测宠物医院提供的犬唾液样品，结果显示为阴性，同病毒分离检测结果一致。

qRT-PCR应用于RABV诊断的同时不断被改进。在nPCR的基础上，Suin等［23］建立了两步法 qRTPCR。在连续的反应中，引物以17%到30%的速度衰减，可将RABV 7种型别全部检测出。最低检测量为组织培养的2/3，得到的RNA曲线与非特异性的qRT-PCR、FAT、病毒滴定法有良好的相关性。敏感性高于FAT，特异性为100%。在TaqMan qRTPCR检查古典RABV中应用“Double Check”策略，能够进一步提高检测过程的安全性和结果的敏感性、可靠性，可检测出目前已知的人和动物所有的RABV类型以及蝙蝠中未知的RABV，也可用于参考实验室 qRT-PCR 方法的分析［10，24］。

2.1.4 基于PCR方法的其他核酸诊断技术 PCR可与Southern blot hybridisation、ELISA方法结合用于RABV的诊断。Aravindhbabu等［25］将RT-PCR和ELISA联合建立了RT-PCR-ELISA，该研究检测了前期证实狂犬病毒为阳性的43个样本的狂犬病毒基因组，该研究证实RT-PCR-ELISA在诊断不同种类死后动物脑组织的狂犬病毒基因组中的敏感性和特异性均为100%，可作为FAT法检测狂犬病毒的替代试验和补充试验。有研究证实将PCR-ELISA与RT-PCR相结合，可区分欧洲蝙蝠狂犬病病毒和经典狂犬病病毒，该法敏感性是PCR-Southern blot hybridisation法的100倍，具有简便、快速和敏感等优点。

2.2 依赖核酸序列扩增技术 与基于PCR方法的核酸诊断技术不同之处在于NASBA的产物是RNA，而前者为cDNA。这一反应依赖于AMV逆转录酶、RnaseH和T7RNA多聚酶的共同作用。当逆转录酶合成 cDNA第一链后，RnaseH降解模板RNA，逆转录酶合成cDNA第二链，T7RNA多聚酶以此cDNA为模板，转录出与样本RNA序列相同的RNA。所用引物中一条包含T7噬菌体启动子序列，能识别T7RAN聚合酶，另一部分针对目的基因中的一段序列。由于所用工具酶的工作适宜温度是37℃，所以只要在第一步变性、复性后，整个反应过程不再需要温度循环。NASBA方法快速、简便，检测死前标本的唾液和脑脊液中RABV的RNA，敏感性高于传统的PCR。依赖核酸序列的扩增-电化学发光技术(NASBA-ECL assay)已被用于死前疑似狂犬病患者的日常诊断中，其敏感性比传统的nPCR高100倍，而且用时短，整个检测过程不超过4 h［6］。但是 Wacharapluesadee等［7］对 NASBA、qRT-PCR 和传统的RT-PCR进行了比较，发现real-time NASBA试验在2例唾液标本的检测中出现了假阴性，从而提示NASBA-ECL可能不适用于RABV的诊断。

2.3 环介等温扩增技术 基于PCR方法的核酸诊断技术所用聚合酶一般为 TaqDNA聚合酶，而LAMP技术利用具有链置换活性的DNA聚合酶和能特异识别靶序列上6个位点的4条引物，恒温条件(60℃ ～65℃)下1 h内，扩增效率可达到109～1010个数量级。

LAMP技术优点是特异性强、灵敏度高、操作简便、结果直观易判读，缺点是容易污染，试剂成本较高。由于LAMP没有特殊的技术要求，操作简便，灵敏度高于nRT-PCR 10倍以上，因此特别适用于基层单位。Muleya等［26］分别针对N基因保守区域的第363-382位、第528-545位、第383-460位和第461-524位核苷酸设计4条引物，用RT-LAMP法检测赞比亚地区的RABV，证明其灵敏性和重复性均较好，可用于日常诊断。Saitou等［27］和 Hayman等［28］证实使用 RT-LAMP法检测RABV十分有效，但若在RABV诊断中推广该技术还需进一步改进。黄元等［29］针对狂犬病病毒的N基因中靠近上游的高度保守区段和L基因中的高度保守区段分别设计了一套引物，建立了检测狂犬病病毒的快速一步式反转录-环介恒温扩增(RT-LAMP)方法。许丹等［30］针对N基因的保守区域设计出LAMP法检测RABV的通用引物，包括2条外引物和2条内引物，其中前者分别针对N基因第24-48位和265-286位核苷酸，后者分别针对N基因第50-71位、第91-112位、第234-255位和第199-223位核苷酸。通过检测17份临床样本，证实LAMP的阳性检出率与传统PCR一致。

2.4 基因芯片技术 基因芯片技术是20世纪80年代中期发展起来的新技术。它是利用杂交测序方法原理，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，具有自动化、微型化、高通量、高度平行性的特点。芯片技术在每份样本中都设置阳性和阴性对照，通过分子杂交予以确认，避免了交叉污染，而且可对多种病毒同时进行检测，有利于大规模推广使用。王振全等［31］针对N基因设计特异性的引物和探针，并将生物素标记在靶基因的上游引物5'端，提高了杂交的灵敏度和特异性。原位多聚酶链反应将原位杂交法ISH与PCR结合，用地高辛标记针对RABV N基因核苷酸保守区域的核酸探针，与神经纤维和神经组织细胞中的病毒核酸杂交，出现蓝色斑点为阳性结果，本法的敏感性和特异性均较高。低密度基因芯片技术融合了基因芯片的基本原理、酶联显色技术的基本原理和核酸分子碱基互补配对的原则，与ELISA和RT-PCR相比，灵敏度高，特异性强。Xi等［32］根据N基因第62-442位核苷酸设计探针，建立了检测RABV的寡核苷酸芯片，可检测RABV的7种基因型，敏感性为100%，并与金标准方法FAT有高度的相关性，尤其适用于不适于FAT检测的高度腐败的脑组织标本。该方法快速、简便、价格低廉，是狂犬病和狂犬病相关疾病诊断的良好选择。

3 结 语

狂犬病是一种呈世界分布的自然疫源性疾病，及时、准确的诊断是控制狂犬病流行的有效方式。核酸诊断技术在RABV的检测中发挥着巨大作用，其检测样本范围十分广泛，可以是感染个体的唾液、脑脊液、泪液、尿液、皮肤、毛囊提取物、感染病毒后的细胞培养物、死前或死后的狂犬病患者脑组织标本等，也可以是不适宜病毒分离和组织学检测的腐败样本，保存时间较长的脑组织样本等［18］。器官捐献可致RABV的传播，核酸诊断技术可检测捐献者是否感染RABV。核酸诊断技术没有标准操作规程，需要严格的质量控制措施避免假阳性结果的出现，因此不被推荐作为RABV死后诊断的常规方法。但是在具备实验条件和专业技术人员的操作下，经过严格的质量控制，可用于RABV死前患者的诊断和流行病学调查中［33］。检测病毒RNA的RT-PCR等方法以其高度的特异性和敏感性以及快速的检测速度使其广泛应用于临床诊断中，成为临床诊断的参考方法［34］。

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