细胞膜脂筏结构蛋白质组与血管内皮细胞功能调控

孙晓丽，朱毅，2△

细胞膜脂筏结构蛋白质组与血管内皮细胞功能调控

孙晓丽1，朱毅1，2△

动脉粥样硬化发病起始于内皮细胞功能紊乱，在动脉粥样硬化病因学方面的工作集中在脂质代谢和炎症反应两个方面。内皮细胞膜表面脂筏结构参与到内皮细胞许多重要的生理功能中：感受细胞内胆固醇水平并参与胆固醇代谢，感受并传导血流剪切力信号，为许多信号分子相互作用提供平台。本文主要针对细胞膜脂筏结构蛋白质组与血管内皮细胞功能调控进行综述。

脂筏；蛋白质组学；胆固醇；他汀类，流体剪切力；内皮功能紊乱

1 脂筏与动脉粥样硬化

1.1 脂筏、小凹（caveolae）与小凹蛋白（caveolin）“脂筏”是细胞膜上具有独特结构和功能的亚细胞器，参与细胞的胞吞、胞饮作用，胆固醇的转运和信号转导，其内富含胆固醇、鞘磷脂、糖鞘脂、酰基鞘氨醇、糖基磷脂酰肌醇，不溶于非离子型去污剂。当细胞高表达caveolin时，脂筏结构向内凹陷形成小凹结构，即caveolae。Caveolae是50～100 nm大小，呈倒置Ω形状的细胞表面小凹［1］。脂筏中的脂类和蛋白质间的相互作用对caveolae结构的形成起关键作用。因此，cave⁃olae是脂筏的特殊结构，在本文中笔者将脂筏和caveolae等同讨论。

Caveolin是caveolae的主要结构蛋白，对维持caveolae的凹型结构至关重要。其中caveolin-1（α、β亚型）和caveo⁃lin-2（α、β、γ亚型）主要存在于内皮细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、上皮细胞、和Ⅰ型肺细胞，而caveolin-3主要存在于各种肌细胞、星形胶质细胞和软骨细胞。在每个内皮细胞表面大约有5 000～10 000个caveolae［2-3］。在内皮细胞中，脂筏参与细胞的胞吞、胞饮、胆固醇的转运和信号转导，是细胞的信号处理中心，具有广泛的调节信号转导作用［4］。

1.2 脂筏与细胞胆固醇胆固醇是脂筏结构必不可少的成分。细胞膜上的胆固醇占细胞内游离胆固醇含量的90%，而脂筏的胆固醇含量又远高于胞膜其他部位。胆固醇对维持脂筏的结构和功能起重要作用。脂筏是细胞胆固醇含量的感受器，介导胆固醇的内流和外流。脂筏的结构蛋白caveo⁃lin-1是胆固醇结合蛋白，参与胆固醇的转运。脂筏和caveo⁃lin的上调或下调与细胞游离胆固醇的外流呈平行关系。无论是新合成的胆固醇还是再循环的、经过加工的胆固醇都被选择性地运送到脂筏。Caveolin-1可与热休克蛋白（heat shock protein，HSP）56、亲环素40、亲环素A和胆固醇形成复合物，这一复合物被称为HSP-亲免素伴侣复合物，它可以结合新合成的胆固醇，并将其从内质网转运至胞膜脂筏。棕榈酰化是caveolin-1与胆固醇的结合、caveolin-伴侣转运复合物的形成及胆固醇向脂筏转运所必需的［5］。脂筏/caveolae可以内陷形成囊泡进入细胞内并与其他膜结构融合。

1.3 脂筏与内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide syn⁃thase，eNOS）NO是保护动脉的关键信号分子，具有促进血管舒张、抑制血小板聚集和黏附、抑制平滑肌细胞增生及单核细胞黏附于内皮的作用。内皮源性NO是由eNOS催化L-精氨酸转化为L-瓜氨酸的过程中生成的［6］。NO生成的减少增加了中性粒细胞黏附于内皮的作用，促进内膜的损伤，是高胆固醇血症诱导的血管病变和动脉粥样硬化早期发病的重要环节。血管内皮细胞NO产生的异常导致内皮细胞的功能失常，可作为动脉粥样硬化发生的前奏。

eNOS高度富集于脂筏内，对脂筏与其底物（L-精氨酸、NADPH、氧）、辅因子（Ca2+、四氢生物蝶呤、黄素）和调节蛋白（钙调素）的相互作用十分重要，同时脂筏对eNOS活性的调节也十分重要。在caveolae内，caveolin-1的脚手架结构域、N-末端和C-末端胞浆结构域都可与eNOS的N-末端氧化酶结构域结合，使eNOS-caveolin复合物定位于脂筏，并干扰eNOS与Ca2+/钙调素的相互作用而发生可逆性的抑制其活性作用。

在静息状态下，caveolin-1抑制eNOS的活性，各种刺激［如缓激肽、凝血酶、血管内皮生长因子（VEGF）、钙离子载体、血流的增加及剪切应激］诱导细胞Ca2+内流，细胞内Ca2+的增加使钙调素代替caveolin与eNOS结合，eNOS进入胞浆内并活化。当细胞内的Ca2+恢复到基础水平，钙调素与eNOS分离，eNOS重新与caveolin结合返回胞膜脂筏，使eNOS失活。HSP90可以促进eNOS与caveolin-1解离而与钙调素结合，从而减弱caveolin-1对eNOS的抑制作用，增加eNOS的活性及NO的产生。

1.4 脂筏与胰岛素受体信号转导在脂肪细胞中，胰岛素受体作为跨膜受体蛋白，主要分布于脂筏当中，与caveolin-1相互结合，功能被抑制，胰岛素刺激引起其磷酸化依赖于完整的脂筏结构。Caveolin-1敲除小鼠存在严重的胰岛素抵抗和高胰岛素血症。

1.5 脂筏与自由基NADPH广泛分布于动脉粥样硬化相关细胞（巨噬细胞、内皮细胞、平滑肌细胞）的脂筏结构中，脂筏结构为自由基产生所必须的结构蛋白组装提供平台［7］。在内皮细胞中，肿瘤坏死因子（TNF）-α、Fas配体、内皮抑素均能刺激脂筏聚集，并激活NADPH，促进氧化反应发生，破坏内皮依赖的血管收缩。

1.6 脂筏与机械信号转导脂筏能感受并传导流体剪切力产生的机械信号，是动脉粥样硬化发病机制中的重要环节。脂筏介导了流体剪切力调节的NO依赖的血管舒张，在机械信号诱导的内皮细胞的极性调节、细胞迁移中也是不可缺少的。有研究报道，脂筏结构的完整性在流体剪切力刺激下的依赖于ATP的钙离子信号中扮演着不可缺少的角色［8］。

有研究发现，敲除caveolin-1的小鼠可以存活，但细胞表面的脂筏结构消失，细胞内吞受损、过度增殖，在整体上表现出肺泡间隔增厚［9-10］；血管中表现为eNOS及整合素功能失调［11-12］，血管内皮与基底膜黏附异常，血管舒缩功能受损，血管渗透性增加［13］；右心室扩大、左室壁增厚、心肌肥大及纤维化［14-15］；免疫反应缺陷、抗感染能力下降［16］；胰岛素抵抗和高胰岛素血症［17］。

Caveolin-1敲除小鼠的动脉粥样硬化发生率降低，ca⁃veoin-1和载脂蛋白（Apo）E双敲小鼠血中，低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c）升高2倍，但动脉斑块却减少70%，CD36和血管细胞黏附分子（VCAM）-1表达量减少，恢复caveolin-1表达会增加斑块面积，其机制可能是：caveolin-1的缺失增加NO产生、减少LDL-c侵入血管壁及抑制白细胞黏附分子表达［18-19］。

有研究表明，破坏细胞骨架，影响其对脂筏结构的支撑作用后，小鼠的动脉粥样硬化反而被加重［20］，原因可能是由于脂筏对不同蛋白的功能存在非常复杂的调节，敲除caveo⁃lin-1或破坏脂筏结构往往引起多条信号通路的变化，并不能完全说明脂筏结构在动脉粥样硬化中扮演的角色。因此，对脂筏蛋白进行高通量研究对于进一步系统地理解脂筏结构在动脉粥样硬化中的作用十分重要。

2 胆固醇与脂筏蛋白质组学

高胆固醇血症是动脉粥样硬化的重要危险因素，当血浆LDL-c水平升高时可以调节细胞游离胆固醇，与内皮脂筏介导的胆固醇外流有关。以前的研究表明LDL-c可以引起Ras、eNOS及caveolin-1向脂筏转位，并伴有这些蛋白的功能改变［21-22］。

为系统研究胆固醇对脂筏内蛋白质的调节，笔者所在课题组用功能蛋白质组学的方法研究了游离胆固醇对内皮细胞脂筏内相关蛋白转位的影响：用游离胆固醇处理内皮细胞4 h后，用蔗糖密度梯度离心的方法提取脂筏蛋白，并用双向电泳技术分离其内蛋白质，然后用质谱技术对差异蛋白进行分析，结果发现双向电泳凝胶上检测的40组蛋白点中，ATP合酶α、β链和78 ku的葡萄糖调节蛋白（GRP78）被上调，而ATP合酶D链，β/γ-actin和Annexin 42被下调。笔者对双向电泳所得的质谱结果进行了验证，并进一步发现ATP合酶β链感受到胆固醇刺激后，与caveolin-1发生结合，并通过细胞骨架滑行由细胞内线粒体向细胞膜上转位，释放更多的ATP，并使磷酸腺苷依赖的蛋白激酶（AMPK）磷酸化增加，对内皮细胞的功能起保护作用。该发现为内皮细胞能量代谢和胆固醇转运之间的关系提供了新的证据［23］。笔者后续的研究发现流体剪切力对细胞膜表面的胆固醇有调节作用：致动脉粥样硬化的流体形式（体外采取洄流进行模拟）能够增加内皮细胞膜表面的胆固醇含量；反之，抗动脉粥样硬化的流体形式（体外采取层流进行模拟）则能减少内皮细胞膜表面胆固醇的含量，这与高胆固醇和洄流致动脉粥样硬化是一致的。进一步研究发现，ATP合酶β链同时还能感受流体剪切力刺激并对内皮细胞功能发挥调节作用。结果证实层流和去除胆固醇均能促进ATP合酶β链自脂筏向线粒体转位，而洄流和胆固醇处理则能促使其自线粒体向脂筏转位，而ATP合酶β链向脂筏中转位的生理意义在于其作为一组特异性T淋巴细胞亚群——γ/δT细胞表面受体（TCR）的特异性配体介导γ/δT细胞与内皮细胞在高胆固醇和洄流刺激下结合，释放炎症因子，从而诱导内皮细胞功能紊乱［24］。

笔者另一项研究发现，在发生炎症反应的内皮细胞中，内皮细胞表面细胞间黏附分子（ICAM）-1被上调，并主要分布于脂筏当中，当受到高胆固醇的刺激后，胆固醇竞争性地抑制ICAM-1与caveolin-1结合，使得ICAM-1从脂筏中被释放出来，并发挥其黏附作用，促进了内皮细胞表面单核细胞的黏附［25］。

3 脂筏的定量蛋白质组学研究

同一种蛋白在不同亚细胞器的定位直接影响其功能，作为信号分子整合的平台，脂筏广泛分布在不同种类的细胞膜表面，研究其内部蛋白质的定位、功能及变化非常必要。

运用液相色谱与质谱连用的定量蛋白质组学的方法，笔者分析了阿托伐他汀和不同形式流体剪切力（脉动流和洄流）处理后内皮后脂筏中的蛋白质转位情况。发现在不同刺激下，300多种蛋白质均发生了转位，其中包括已报道的ATP合酶β链。笔者将所得到的大量蛋白质进行功能分类，并挑选其中受调节显著，并可能与动脉粥样硬化发病相关的蛋白质进行进一步分析，结果显示，阿托伐他汀引起内皮细胞中ERp46向脂筏转位，从而加强ERp46与Nox2的相互作用，进而发挥着抗氧化作用［26］。而在脉动流和洄流刺激的内皮细胞中，笔者挑选了整合素α5进一步研究，结果发现，不同剪切力反向调节其在细胞骨架和caveolin-1介导下脂筏内的转位，抑制或激活其功能，影响其泛素化水平，进而反向调节内皮细胞炎症反应。在整合素敲除小鼠中也表现出洄流引起的内皮炎症反应减轻的表型（待发表）。

内皮细胞脂筏结构在动脉粥样硬化中扮演多方面角色。一方面，脂筏广泛分布于内皮细胞膜上，能感受到来自外界环境的多方面刺激，如血中胆固醇、炎症因子、胰岛素等的水平，血流动力学改变等，是内皮表面的信号感受器，能感受外界环境的变化并传递信号帮助细胞作出相应的反应。另一方面，作为蛋白质整合平台，脂筏内存在大量的信号分子，参与整合复杂的信号通路传导。

脂筏结构复杂，富含脂质、caveolin结构蛋白，这些都能从各方面影响其功能，不同的信号通路在动脉粥样硬化发病中扮演者复杂甚至相反的角色，因此，不同手段破坏脂筏结构（如敲除caveolin-1、去除胆固醇等），在疾病模型中可能存在不同的表型。未来对于脂筏的研究，可能需要结合蛋白质组学、脂质代谢组学、形态学研究等多平台手段进行系统研究，在不同疾病、不同外界环境刺激中发现更特异的机制，为有针对性地疾病预防和治疗提供依据。

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（2015-07-14收稿2015-07-30修回）

（本文编辑闫娟）

R543.5，R363

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.08.004

国家自然科学基金重点资助项目（81130002）

1北京大学医学部生理学与病理生理学系；2天津医科大学生理学与病理生理学系

孙晓丽（1987），女，博士，主要从事血流动力学改变与内皮细胞功能调控的研究

△通讯作者E-mail：zhuyi@tijmu.edu.cn