晚期糖基化终末产物受体在腹腔感染脓毒症中的研究进展

廖延年综述，黄 骞，黎介寿审校

0 引 言

严重腹腔感染所导致的脓毒症病情凶险、进展迅速、预后险恶，进一步发展可导致脓毒性休克、多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，给临床救治工作带来极大困难，始终是现代危重病医学面临的重大问题。尽管对脓毒症概念及临床特征的认识有所进步，但严重脓毒症、MODS 的临床试验性治疗大部分仍只是对症治疗，且常常收效甚微［1-2］，其病死率仍居高不下(50%～80%)［3］。其原因与脓毒症和MODS 的根本发病环节及作用机制尚未充分阐明相关。近年来，关于晚期糖基化终末产物受体(receptor of advanced glycation endproducts，RAGE)的研究越来越多，在脓毒症的发生发展中关于RAGE 的作用也逐渐受到关注［4］。

1 RAGE 的结构与功能

RAGE 的命名是由于最早被发现和描述能与晚期糖基化产物结合［5］。它是一种膜表面受体，属于免疫球蛋白超家族一员。其结构包括1 个憎水性的跨膜结构域、1 个胞质内尾段以及1 个胞外段，其中胞外段由1 个N 端V 型结构域、2 个C 型结构域组成。研究普遍认为V 结构域是RAGE 和胞外配体结合的主要位点，而胞内尾段则与胞内信号转导有关。而RAGE 的某种剪切异构体，缺乏跨膜区与胞内尾段，游离于血浆中，称为可溶性RAGE(soluble RAGE，sRAGE)。由于其具有V 结构域，可与配体结合，但不会引发下游的信号转导，可竞争性抑制RAGE-配体相互作用，对细胞和组织起到保护作用［6］。

RAGE 广泛分布在单核-巨噬细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、肾小球系膜细胞、肿瘤细胞、星形胶质细胞、淋巴细胞等细胞表面。可与β 淀粉样肽、高迁移率族蛋白1、钙结合蛋白S100 家族等众多配体结合［6-7］。RAGE 与配体相互作用常导致快速持续的细胞活化和下游基因转录，主要是丝裂原活化激酶蛋白家族信号通路的4 个亚型，即ERK5、JNK 酶类、p38、ERK 激酶在不同类型细胞中被激活，并通过核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)持久活化持续和扩大炎症反应［8］。

2 RAGE 与炎性反应

众所周知，脓毒症的实质就是感染及其导致的全身炎症反应(several systemic inflammatory response，SIRS)［9］。RAGE 被认为参与脓毒症的病理生理过程主要是源于其在炎症反应的始动和持续作用中扮演重要角色，而在众多关于急慢性炎症的研究中也得到证实［10］。

在炎症反应的过程中，中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、B 淋巴细胞、T 淋巴细胞乃至树突状细胞细胞均扮演重要角色，研究发现，在这些细胞中均有RAGE 的表达［11-13］。而在这些细胞中RAGE 的高表达状态与炎症反应密切相关。而RAGE 也可进一步对各种炎症细胞产生影响。以T 细胞为例，研究发现，RAGE 在T 细胞中的表达水平是与T 细胞的分化类型有关的，在抗原诱导的免疫细胞增殖过程中，RAGE 配体激活的RAGE 可能参与了Th1+细胞分化的最终启动阶段。在RAGE 基因敲除的T细胞研究中，Th2 细胞产生的细胞因子类如白细胞介素(interleukin，IL)-4、IL-5 有所增加，而Th1 细胞产生的细胞因子如IL-2、γ 干扰素则有所减少，提示RAGE 的激活对平衡Th1 和Th2 细胞免疫有一定作用［13］。不仅如此，在内皮细胞中，RAGE 亦有表达，能与白细胞β2-整联蛋白-Mac-1 完全相互作用，RAGE-Mac-1 的交互作用使RAGE 具有白细胞黏附受体的作用［14-15］。体外实验和动物实验均显示，RAGE 可作为白细胞整联蛋白的反受体参与炎性细胞募集反应。RAGE 作为内皮细胞黏附受体并吸引白细胞的能力使其可直接调控白细胞的募集。与此同时，RAGE 介导的免疫细胞活化和促炎因子、黏附分子的上调也间接的促进了炎性细胞的募集［14，16］。

RAGE 信号通路始动于RAGE 与其众多配体的结合，高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein，HMGB1)、晚期糖基化产物、S100B 等均被证实参与急慢性炎症反应［17-18］。这些配体从分类上属于损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMP)，而RAGE 与病原体相关份子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)的直接作用则少有研究。然而Yamamoto 等［19］研究发现，RAGE 可以与脂多糖直接结合，诱发炎症反应，提示RAGE 可能既结合DAMP，也能结合PAMP。作为重要的促炎因子，NF-κB及其下游靶向基因的转录在RAGE 的激活后得到启动，而激活的NF-κB亦能调控RAGE 的转录。研究发现在RAGE 基因的近端启动子区域可以找到NF-κB 的功能性结合位点也证实了这一点［20］。在RAGE 和NF-κB 的相互作用下，形成恶性循环，炎性反应持续存在。

3 RAGE 与腹腔感染脓毒症

为探寻RAGE 在腹腔感染、脓毒症中的具体影响，研究人员采用了众多的方法来抑制RAGE 信号通路的活性，这些方法包括靶向RAGE 的抗体、RAGE 基因敲除、siRNA 沉默RAGE 基因、靶向RAGE 配体的抗体以及sRAGE 等。早期研究的对象主要集中在RAGE 的众多配体，尤其是HMGB1。在细胞实验中，胆碱能激动药成功的抑制了巨噬细胞中HMGB1 的分泌，其抑制作用可能主要是在于HMGB1 的细胞质转运的阻断，而与转录翻译水平无关，使用胆碱能激动药的实验组的小鼠相对对照组的小鼠有着显著的生存率的上升，同时循环中的HMGB1 的含量也减少了60%［21］。另一项类似研究中，使用抗HMGB1 抗体后，小鼠的生存率得到明显改善，而循环中的促炎因子如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、IL-6 均 有 明 显 下降［22］。Suda 等［23］在大鼠盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)模型上进行的脓毒症大鼠中HMGB1 的研究同样发现，相较于对照组，注射抗HMGB1 抗体组的大鼠的生存率有明显的改善，血清以及肺组织中HMGB1 阳性细胞的数量也有明显减少。众多实验研究证实，以HMGB1 作为靶点进行干预，可以起到控制炎性反应的作用。然而，HMGB1 不仅可以与RAGE 结合，它也是toll 样受体(toll-like receptor，TLR)2、TLR4 的重要配体，仅针对HMGB1 的研究不能完全诠释RAGE 的作用［24］。

随着研究的逐渐深入，研究者们的目光逐渐的转向了靶向RAGE 本身的研究。Lutterloh 等［25］在CLP 小鼠模型中发现，相较于野生小鼠组的较低7 d生存率，杂合子小鼠(RAGE+/-)组和纯合子RAGE基因敲除小鼠(RAGE-/-)组的7 d 生存率都有显著的提高。而在针对需氧革兰阳性菌和革兰阴性菌的组织培养中，各手术组小鼠肝、脾以及腹膜灌洗液中的菌群数量除了比假手术组明显多以外，各组小鼠间无明显差距。进一步运用RAGE 单抗的实验发现，无论是术前还是术后24 h 内给予RAGE 单抗，小鼠的7 d 生存率均有显著上升。在产单核细胞李斯特菌的半数致死量的研究中，RAGE 杂合子小鼠、RAGE 基因敲除小鼠以及RAGE 单抗处理过的小鼠均表现出极大的耐受力，甚至超过2 倍于野生小鼠［25］。另外一项CLP 小鼠模型研究中，RAGE 单抗处理过的小鼠，其炎症反应过程中的众多基因包括Socs3，Tnfaip3，Il17rd，Calcrl 和Ramp3 等的表达均受到抑制。脓毒症若伴随器官功能障碍，其治疗难度将大大增加，为证实谷氨酰胺在脓毒症诱发急性肾损伤的治疗改善作用，研究人员利用CLP 小鼠模型进行实验，预防性运用谷氨酰胺后，小鼠的生存率得到改善，而HMGB1 和RAGE 的表达均下调，NF-κB信号通路受到抑制。在大鼠的CLP 模型中，谷氨酰胺在急性肺损伤中的作用研究也得到了类似的结果［26］。

除此以外，由于可溶性RAGE 结构的特殊性，sRAGE 也被用来进行腹腔感染、脓毒症的研究。Yamamoto 等［19］研究发现，在注射脂多糖诱导脓毒性休克小鼠模型中，sRAGE 预处理小鼠后，不论是野生型小鼠、还是RAGE 基因敲除小鼠，其炎性因子IL-6、TNF-α 均有明显下降，生存率也有明显改善，这种改善效果甚至超过了单纯RAGE 基因敲除小鼠组。提示sRAGE 不仅可竞争性抑制RAGE，也可竞争性抑制脂多糖的其他受体包括TLR-2、TLR-4。在另一项小鼠CLP 模型的研究中，用sRAGE-Fc 融合蛋白处理后的小鼠获得了更高的存活率，肺组织的炎症评分及其IL-1β、TNF-α、IL-6 的表达水平均有明显的下降［27］。而更有现实意义的是，有临床试验表明，脓毒症患者的预后与患者体内的sRAGE 水平可能有着一定的关系。Brodska 等［28］发现，在纳入研究的54 名脓毒症患者中，相对于在28d 内死亡的16 名患者，幸存的38 名患者首日的sRAGE 处于明显更低的水平。而在第3 天，死亡组患者的血液sRAGE 水平较第1 天有着明显的上升，而存活组的患者血液sRAGE 水平仍然保持较低水平。同时，在所有患者中，sRAGE 的水平与常用的炎性指标C 反应蛋白以及降钙素原有关。提示sRAGE 可作为早期提示脓毒症患者预后的生物指标。

众多的腹腔感染、脓毒症的实验研究显示，RAGE 参与腹腔感染、脓毒症的发生发展，抑制RAGE 的活性对于腹腔感染、脓毒症具有正面作用，炎症反应受到抑制，器官功能障碍得到改善，生存率显著上升。这些研究结果显示，RAGE 信号通路对于腹腔感染的预后有着消极的作用，然而这是否说明RAGE 信号通路完全无益?

2009 年Zoelen 等［29］首先给出了否定的答案，在大肠杆菌腹膜炎的小鼠模型中发现，RAGE 基因敲除小鼠在腹膜注射大肠杆菌的20 h 之后，腹膜腔内菌群生长速度、感染播散速度比野生型小鼠有明显提升，肝细胞损伤、系统性炎症因子释放以及凝血功能障碍也较后者加剧。而野生型小鼠使用抗RAGE IgG 处理后也得出相同的结果。这些结果证实RAGE 信号通路在大肠杆菌导致的腹膜炎中具有保护性作用，其原因可能与伴随的炎症和促凝血反应受到抑制有关。而进一步的实验中，运用sRAGE 和抗HMGB1 后，得到了和RAGE 基因敲除相同的结果［30］。在另外一项类似的研究中，与RAGE 基因敲除小鼠相比，野生小鼠中的中性粒细胞表现出明显更强的大肠埃希菌杀灭能力。而RAGE 的3 种主要配体AGE、S100B、HMGB1 表现出不同的作用，AGE、S100B 增强了中性粒细胞中还原型辅酶II(NADPH)氧合酶的作用，使其杀灭大肠杆菌的作用增强，而HMGB1 则与之相反［31］。不仅如此，HMGB1 还能与凋亡相关蛋白caspase-1 相作用，解除凋亡诱发的免疫耐受，使脓毒症小鼠的二次感染的易感性大大降低，免其受到二次打击，对机体产生保护作用［32］。

尽管如此，我们并不能绝对说明他们得出了完全矛盾的结果。感染引发的炎性反应很多时候表现出来像一把双刃剑，一方面保护机体，使其免受病原体的侵袭，另一方面，也能对细胞和组织产生损伤。前述实验中CLP 模型与大肠杆菌诱导的腹膜炎模型也有着明显的不同。一般而言，前者病情一般较重，死亡率较高，而后者病情较稳定，死亡率相对较低，而且值得注意的是，CLP 一般研究的是晚期炎症反应，而腹膜炎模型关注于早期机体对感染的抵御作用。在腹腔感染疾病的早期，着重于控制感染是主要目标，而在疾病发展加重至脓毒症乃至脓毒性休克的阶段时，由于抗生素的使用，菌群对疾病的影响相较严重的SIRS 而言重要性降低。此时针对SIRS 进行干预对预后意义更为重大。

4 结 语

基于各种实验的研究，我们认为抑制RAGE 活性对于严重腹腔感染、脓毒症是有益处的。毫无疑问，RAGE 在治疗学上可成为一个有效的靶点。然而，至少还有两个关键的问题需要解决。一是必须明确靶向RAGE 的治疗在临床上的优点以及缺点;二是需要了解RAGE 阻断对临床受试者的远期影响。因为RAGE 在抵御病原体侵袭方面有着不容忽视的作用，因此显得极为重要。要解决这些问题，需要开展进一步深入的研究，才能将理想中的治疗策略变成现实。

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