RET基因甲基化在先天性巨结肠发生机制中的作用

张树建，张辉，詹江华

RET基因甲基化在先天性巨结肠发生机制中的作用

张树建，张辉，詹江华△

目的研究原癌基因RET的甲基化与先天性巨结肠（HD）之间的关系，了解其在肠壁神经节细胞发生发展中的意义。方法选取天津市儿童医院诊治的HD手术切除病变组织标本21例为试验组，均为扩张段；同期非HD患儿正常结肠组织标本5例，为对照组。应用亚硫酸氢盐测序法（BSP）直接检测方法检测RET的CpG岛甲基化状态，用免疫组织化学方法检测试验组和对照组中RET蛋白的表达情况。结果试验组RET的CpG岛有12例（57.14%）发现甲基化，对照组标本均未发现甲基化。12例甲基化RET的蛋白表达的平均光密度为0.201±0.015，低于9例非甲基化RET的蛋白表达的平均光密度，为0.364±0.023，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论RET基因甲基化可能通过影响RET蛋白的表达水平，影响神经节细胞的发育，从而参与HD的发生。

Hirschsprung病；原癌基因蛋白质c-ret；免疫组织化学；甲基化

先天性巨结肠（Hirschsprung’s disease，HD）是一种常见的消化道发育畸形，发病率为1∶5 000。HD的发生机制主要与原癌基因RET、EDNRB突变，以及肠道神经系统发育的内环境有关［1］。原癌基因RET是目前HD的最关键基因，参与神经脊细胞的定向迁移［2］。表观遗传学（甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化等不改变碱基序列的可逆性修饰）是近年来的研究热点［3］。本研究通过检测HD患儿病变组织标本原癌基因RET甲基化状态及其扩张段蛋白水平的表达差异，旨在探讨原癌基因RET启动子上游CpG岛与HD发病的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料选自天津市儿童医院2010年1月—2012年3月诊治的HD患儿21例为试验组，年龄2 d～11岁，其中男19例，女2例，均为散发，否认家族史；均经手术和病理诊断为HD。其中正常段所取部位经病理证实神经节细胞正常，且扩张段肠管为全层组织。对照组选取我院同期非HD患儿5例，年龄5个月～8岁，男3例，女2例，结肠重复畸形3例，结肠淋巴管瘤2例。

1.2方法

1.2.1实验仪器DK-8D型电热恒温水槽（上海森信实验仪器有限公司），DYY-8型稳压稳流电泳仪（上海琪特分析仪器有限公司），YXJ-2离心机（湘仪离心机仪器有限公司），H6-1微型电泳槽（上海精益有机玻璃制品仪器厂），凝胶成像系统（Gene Genius公司），U-3010紫外-可见分光光度计（Hitachi公司），PCR反应扩增仪、移液器（范围100～1 000 μL，20～200 μL，0.5～10 μL）（加拿大BBI公司）；组织脱水机ASP200（Leica Microsystems GmbH），石蜡包埋机BMJ-1（天津天利航空机电有限公司），石蜡切片机M1210（Thermo Shandon Ltd），烤箱（SANYO Electric Co.Ltd），微波炉（格兰仕集团有限公司），烤片机（Leica），冰箱（三洋），光学显微镜（Olympus）和计算机图像分析系统（Leica Microsystems Wetz⁃lar GmbH 020-519.010LB30T，Germany）等。

1.2.2主要试剂NaHSO3（分析纯）、NaOH、氢醌、TaqDNA聚合酶及dNTP、PCR产物纯化回收试剂盒（SK1261）均购自上海生工生物工程有限公司；粘片剂：0.1 g/L多聚赖氨酸溶液，购于北京博奥森生物技术有限公司；兔抗人RET免疫组化多克隆抗体（北京博奥森公司）；即用型非生物素广谱二抗（上海长岛生物技术有限公司）。DAB显色试剂盒：购于上海长岛生物技术有限公司，包括A瓶（DAB底物缓冲液）、B瓶（DAB色原）。常规试剂：苏木素染液、伊红染液；0.01 mol/L PBS（pH7.2～7.4）；0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液（pH 7.6）等。

1.2.3亚硫酸氢盐测序法（bisulfite sequencing PCR，BSP）26例标本全层结肠组织各30 μg行DNA的提取和纯化；DNA亚硫酸氢钠修饰：约2 μg DNA于1.5 μL EP管中使用DDW稀释至50 μL，加5.5 μL新鲜配制的3 mol/L NaOH，42℃水浴30 min。加10 mmol/L对苯二酚（氢醌）30 μL至上述水浴后混合液中，溶液变成淡黄色，加520 μL 3.6 mol/L亚硫酸氢钠至上述水浴后溶液中。EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。加200 μL石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化，50℃避光水浴16 h；修饰后DNA纯化回收。RET基因甲基化PCR扩增引物，上游5′-TGGGGGAAA ATTGGATTTTTTTTTTTTTTT（CT）GT-3′，下游5′-ACTTA⁃CAATCCCTACCTTTTACCCTTTCC（AG）C-3′，产物长度为485 bp，且RET有26个CpG岛。内参为GAPDH，上游5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3′，下游5′-CATGT⁃GGGCCATGAGGTCCACCAC-3′。反应体系为50 μL，其中DNA 3 μL，引物F 1 μL，引物R 1 μL，dNTP 1 μL，Taq Buffer 10×PCR Buffer（with Mg2+）5 μL，Taq酶（5 U/μL）0.8 μL，水38.2 μL。PCR反应条件：98℃4min，94℃45s，66℃45s，72℃1min，每个循环退火温度递减0.5℃，20个循环。94℃45 s，56℃45 s，72℃1 min，20个循环，72℃8 min。PCR电泳与回收参照试剂盒SK1261。检测结果得出各组甲基化样本数。

1.2.4HE及免疫组织化学染色方法应用HE染色证实神经节细胞存在，免疫组化染色RET。免疫组化染色方法：常规切片厚5 μm，脱蜡至蒸馏水，再用0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，3%过氧化氢消除内源性过氧化物酶活性，然后加入稀释好的一抗，4℃过夜。二抗采用SP试剂盒，DAB显色，苏木素复染，最后脱水透明后封片。

1.3结果判定（1）定性判定：光镜下发现棕黄色物质为阳性反应，其密度与部位即为RET表达的多少与分布，本实验选择肌间神经丛，计算机成像系统摄取图像，存盘。（2）定量判定：在相同放大倍数的显微镜下拍摄的图片中，病理切片均随机取肠壁肌间神经丛3～7个高倍镜视野，有经验的病理科医师进行阳性染色结果鉴定，计算机图像分析软件（Im⁃age-Pro-Plus）分别计算3～5个视野中的神经丛中棕黄色染色的平均光密度，再取其平均数。

1.4统计学方法数据处理用SPSS 17.0统计软件包，计量资料用表示，两独立样本均数比较采用t检验；甲基化率的比较采用Fisher’s确切概率法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1HE在肠神经丛的染色情况试验组扩张段与对照组中典型的神经节细胞容易辨认，见图1、2。

2.2免疫组化染色结果在HD扩张段中，甲基化与非甲基化RET基因表达蛋白阳性染色均在细胞浆弥漫出现，在细胞膜有阳性染色。肠壁肌间神经丛和黏膜下神经丛内均可见RET阳性表达，见图3、4。

2.3BSP直接测序结果21例HD病变组织标本有12例（57.14%）发生甲基化，5例阴性对照组标本均未发现甲基化，差异有统计学意义（P=0.042）。

2.4免疫组化染色图像分析RET蛋白在HD扩张段的神经丛中12例甲基化样本的平均光密度为0.201±0.015，9例非甲基化样本的平均光密度为0.364±0.023，差异有统计学意义（t=9.269，P＜0.05）。

3 讨论

RET作为一个跨膜酪氨酸激酶受体，并且还是神经胶质细胞源性神经营养因子（glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF）家族的受体，被证明是引起HD的主要基因［2］。RET基因定位于10q11.2区，长约80 kb，有20个外显子，其编码产物RET蛋白是一种酪氨酸激酶（tyrosine kinase，TK）受体，其基本功能是将细胞外信息转变为传入细胞内的化学信号，对肠神经系统的发育起重要的作用。

基因的表观遗传学对DNA的甲基化修饰研究较早，提出正常的甲基化对于维持细胞的生长及代谢等是必需的，异常的DNA甲基化则会引发疾病（如肿瘤），因为异常的甲基化一方面可能使抑癌基因无法转录，另一方面也会导致基因组不稳定［3-4］。DNA甲基化在基因表达上的调控作用是导致基因的失活，即基因沉默。这种调控作用从本质上说是一种DNA水平的调控，从效果上说是直接影响基因的转录。DNA甲基化也可以促进基因突变，产生编码蛋白数量的减少或蛋白质功能异常，导致细胞发生缺失或功能异常。既往研究表明RET缺失突变可引起RET受体蛋白水平或活性降低，从而影响RET配体GDNF的磷酸化活性和生物功能、组织神经嵴源性细胞的正常发育，导致HD［5］。多数对RET原癌基因的研究是关于其突变诱导疾病产生，GDNF/RET信号传导通路在肠神经系统发生发展过程中扮演了非常重要的角色［6］。该通路主要是对肠神经脊细胞的扩增、分化及迁移有至关重要的作用。

本研究结果表明，21例标本中12例发现甲基化，甲基化标本RET的蛋白表达的平均光密度较非甲基化组低，由此可见RET甲基化致其蛋白的表达下降，进而可能导致HD发生，这与Hindorff等［7］的实验结果一致。Uesaka等［8］发现，当小鼠RET基因表达水平降为原来的50%时，会出现类似于HD样无神经节细胞肠段。基于此，笔者推测，甲基化修饰是一种不改变DNA碱基序列的可逆性基因表达调控过程，其启动子上游富含CpG岛区域可能主要干扰mRNA的合成，进而影响rRNA，导致蛋白表达水平下降。RET基因甲基化致其mRNA表达水平下降到一定程度后才有可能导致RET基因的表达沉默，进而形成HD，但相关理论还有待进一步证实。

总之，对RET基因甲基化研究的深入会对HD的发病机制有更进一步了解。DNA甲基化是一种高于基因组序列水平的基因表达调控机制，其在表观基因组水平精确研究正常和疾病组织DNA甲基化模式的特征和差异，揭示如肿瘤、HD等疾病的表观遗传学机制，并将DNA甲基化模式的改变与基因沉默、年龄相关变化和疾病特异性改变联系在一起，将是一个有前景的研究领域。

（图1～4见插页）

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（2014-10-14收稿 2015-02-10修回）

（本文编辑 魏杰）

The role of RET proto-oncogene methylation in the pathogenesis of Hirschsprung's disease

ZHANG Shujian，ZHANG Hui，ZHAN Jianghua△
Department of Surgery，Tianjin Children’s Hospital，Tianjin 300074，China△

ObjectiveTo investigate the relationship between the methylation of RET（proto-oncogene，RET）and Hirschsprung disease（HD），and understand its significance in the development of intestinal wall ganglion cells.Methods Twenty-one surgical removal specimens，which were all dilation segment of HD in Tianjin Children’s Hospital，were used as experimental group，and 5 samples of non-HD normal colon tissues were used as control group.The bisulfite sequencing（BSP）-direct detecting method was used to detect RET CpG island methylation status.The expression of RET protein wasdetected by immunohistochemistry in experimental group and control group.ResultsIn the experimental group 12 cases（57.14%）were found methylation，but no methylation was found in control group.The average optical density of methylated RET protein was 0.201±0.015 in 12 cases.The average optical density of un-methylated RET protein was 0.364±0.023 in 9 cases（P＜0.05）.ConclusionRET CpG island methylation reduced protein expression levels of RET.The corollary RET gene methylation may influence the expression levels of RET protein，thereby affecting the ganglion cell development，and thus participating in the occurrence of HD.

Hirschsprung disease；proto-oncogene proteins c-ret；immunohistochemistry；methylation

R574.62

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.07.015

天津市儿童医院外科（邮编300074）

张树建（1983），男，硕士研究生，主要从事先天性巨结肠方面研究

△通讯作者E-mail:zhanjianghuatj@163.com