类风湿关节炎动物模型在中医药研究中的进展

张星华,杜小正*,王金海,袁 博,田 亮,朱博雯

(1.甘肃中医学院, 甘肃 兰州 730000; 2. 兰州大学第二医院 中医科, 甘肃 兰州 730000)



类风湿关节炎动物模型在中医药研究中的进展

张星华1,杜小正1*,王金海2,袁 博1,田 亮1,朱博雯1

(1.甘肃中医学院, 甘肃 兰州 730000; 2. 兰州大学第二医院 中医科, 甘肃 兰州 730000)

类风湿关节炎(RA)是以慢性滑膜炎为病变的全身性自身免疫疾病。目前RA的病因及发病机制仍不明确，尚缺乏有效的预防手段和根治办法，动物模型的研制是医学科研的重要步骤，选择与人RA相近的动物模型是实验研究的基础。就近年来应用于类风湿关节炎( RA) 实验研究的动物模型进行简要概括，以期为RA 研究选择理想的实验模型提供参考。

类风湿关节炎；动物模型；病证结合；综述

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是以慢性滑膜炎和血管炎为病理基础的自身免疫性疾病。我国RA的患病率为0.2%～0.4%，RA不积极治疗会引起关节畸形，严重者可丧失劳动能力[1]。动物模型为RA的研究提供了实验载体，病证结合模型的建立给中医药治疗RA提供了新的实验思路，本文就近几年常用的RA动物模型进行概述及归纳，以期为RA模型提供实验依据。

1 胶原诱导的关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型

CIA模型是Trentham等[2]在1977年发现约50%的RA患者血清和关节滑液中存在着抗胶原的自身抗体，Ⅱ型胶原是一种与免疫系统隔绝的蛋白，但在某些病理条件下可作为一种自身抗原呈现出来，鸡、牛、大鼠、小鼠的胶原均可刺激机体产生抗Ⅱ型胶原抗体，根据这一理论，创建了CIA模型，CIA模型的病理特征、临床表现及免疫学特点与RA极为接近，是目前国际比较公认的RA模型。此模型制备[3]用0.1 mol/L的冰乙酸溶解天然牛Ⅱ型胶原(2g/L)，再与等体积的不完全佐剂(IFA)乳化混匀，以0.2 mL/只的剂量在大鼠背部和尾根部进行皮内多点注射免疫，1周后相同剂量加强注射。CIA大鼠[4]在注射部位会出现小的溃疡，大鼠摄食、饮水量减少，毛发粗糙枯槁，腹泻以及体重增长迟缓等全身表现。活动受限先是后足出现红肿僵直症状，皮温升高，随后波及前足，且后足症状普遍比前足严重，大鼠行动明显迟缓，在注射4天后侵袭至对侧足跖，双侧足跖肿胀，红肿逐渐加重，蔓延至前足和尾根部，活动受限约在致炎后第9天，加强免疫后大鼠出现关节畸形和限制性步态，致敏20天关节肿胀程度达高峰，关节炎指数积分最高，致炎28天后关节肿胀逐渐消退，但不会彻底消失。

研究发现[5-6]CIA模型大鼠的炎性反应和足趾宽度、厚度、面积及关节积分存在较强的相关性，并与最后的病理变化呈正相关，足跖大小及关节积分可作为模型炎症状态的评定标准。关节炎积分指数与血管内皮生长因子表达水平、微血管计数呈正相关，表明血管内皮生长因子在类风湿关节炎血管翳形成过程中发挥重要作用。病理切片[7]显示滑膜细胞水肿变性，细胞排列不整齐，3～5层明显增生，滑膜组织中大量炎性细胞浸润聚集，以T、B淋巴细胞浸润为主；滑膜内血管扩张充血，血管内膜变形增生，血管翳形成，纤维组织增生，严重者可见滑膜下骨和软骨侵蚀破坏。光镜下[8-9]可见滑膜细胞广泛增生，排列疏散、紊乱，滑膜细胞层次增多；滑膜下层纤维结缔组织增生，纤维素变性，胶原纤维沉着，滑膜脂肪垫水肿；大量炎性细胞浸润并呈灶性聚集，新生肉芽组织形成；软骨细胞减少，可见变性、坏死，赘生物形成，血管增生明显。影像学[10]显示四肢关节软组织对称性肿胀，骨皮质变薄，骨小梁稀疏，关节间隙变窄，伴有骨质侵蚀，严重者关节可发生融合，多以小关节破坏为主。

RA患者滑膜组织和滑膜液中含有大量T细胞，T细胞活化可释放大量炎性细胞因子如IL-1、IL-7、TNF-a、IFN等，Ⅱ型胶原(CⅡ)激活T细胞和B淋巴细胞，侵入滑膜组织，并在病变关节释放炎性因子，随后中性粒细胞、巨噬细胞趋化聚集，血管内皮生长因子表达增加，形成血管翳。研究证实[11]T细胞受体(TCR)疫苗可诱导机体对致病性T细胞表面抗原受体(TCR)的免疫应答，选择性杀伤致病性T细胞或使其活性消失，从病因上治疗类风湿关节炎，但此疫苗受主要组织相容性抗原(MHC)限制，无法大批量生产，难以广泛应用于临床。

2 佐剂性关节炎(adjuvant arthritis，AA) 模型

AA是细菌学家Freund[12]在20世纪50年代率先建立的免疫性关节炎动物模型，又称弗氏佐剂性关节炎。弗氏佐剂分为完全佐剂和不完全佐剂两大类，弗氏完全佐剂(CFA)是用液体石蜡与无水羊毛脂按2∶1比例混合的混合液体，高压灭菌，加入80℃灭活1h的减毒卡介苗或干燥结核死菌合成。不加卡介苗的为不完全佐剂(IFA)。造模多数是在大鼠足趾皮内注射弗氏完全佐剂(CFA)0.1mL致敏，但其他研究表明，0.15mL剂量可能是RA模型复制中的最佳注射量[13-14]。改良的弗氏完全佐剂[15]是选择吐温80(Tween 80)代替无水羊毛脂，液体石蜡和Tween 80以3︰1的比例混合均匀，高压灭菌后4℃保存备用，操作时加入卡介苗(10g/L)、Ⅱ型胶原纤维(5g/L)配制成弗氏完全佐剂。改良弗氏完全佐剂致敏的大鼠关节炎出现时间和病理结构变化与弗氏完全佐剂相似，但抗原特异性更强。另有研究[16]发现环瓜氨酸肽辅助完全弗氏佐剂致敏的关节炎大鼠与普通AA模型相比，在关节肿胀积分与病理形态变化方面没有明显差异，但血清IL-6、TNF-a、类风湿因子(RF)、抗环瓜氨酸肽(anti-CCP)均较AA模型显著升高。说明RA模型的建立不仅要从病理形态学上观察，更应结合RF、anti-CCP等血清学指标综合分析评价，表明CCP可以作为辅助剂用于RA模型的研究。AA[17]致炎后大鼠精神萎靡，体毛不光泽，饮食、活动减少，蜷缩，大便稀溏，体重减轻。大鼠足趾部位均出现明显红肿僵硬，皮温升高，AA大鼠致炎后15h，致炎侧足肿胀达高峰，持续2～3天逐渐减轻，7～8天后再度肿胀并出现左膝关节肿胀，注射部位出现溃疡并有跛行、拖退等现象。继发病变于致炎后10天左右出现，表现为对侧和前足肿胀，逐渐扩展到前足跖趾关节、踝关节，活动障碍明显，28天后继发侧足爪肿胀开始下降。病理切片[18]显示关节腔内纤维组织增殖明显，淋巴细胞、浆细胞及巨噬细胞明显浸润；滑膜细胞增生，形成明显的肉芽组织，典型的淋巴滤泡形成；关节囊内充血、水肿明显，软骨细胞溶解死亡，软骨和骨骺破坏。

AA[19-20]大鼠关节局部和血清中IL-1、IL-6、TNF-a、INF-γ和一氧化氮(NO)等细胞因子及炎症介质的含量均明显升高，可抑制骨髓红细胞造血功能，出现类似人RA贫血症状。AA大鼠白细胞明显上升，表明白细胞参与并介导AA大鼠关节炎的形成与发展。AA大鼠[21]外周血IL-1β、TNF-α、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、褪黑素(MLT)的峰值均出现在夜间，可为临床选择合理的用药时间提供依据。AA模型[22]对骨的破坏比较明显，对软骨的破坏没有RA严重，不产生类风湿因子，对胃肠道、生殖系统、皮肤及眼睛均有影响。

AA模型发病机制[23]是分子模拟作用，结核杆菌的相对分子量是65ku热休克蛋白( Hsp65) ，与AA大鼠关节软骨自身抗原Hsp60的分子结构相似，可被同一株T细胞克隆所识别，激活原来处于静止状态的针对以CⅡ抗原为主的各种自身抗原的淋巴细胞克隆，从而诱发关节的自身免疫反应。

3 卵蛋白诱导的关节炎模型

此模型制备[24]是浓度为4g/L的卵蛋白溶液与等量的弗氏完全佐剂(CFA)在1 500r/min快速混匀器下制成乳化剂，在家兔肩背部均匀选定6个点，每个点皮下注射乳化剂溶液0.2mL。两周后再以同样的方法、剂量每点重复皮下注射1次。第2次免疫完成后7天，在家兔双膝关节分别注入20g/L卵蛋白生理盐水溶液0.4mL。24h关节直径和表面温度升高，关节直径可增加32%，出现急性滑膜炎和大量渗出液，2周后关节肿胀逐渐减轻，恢复至平台期。1～4周关节滑膜显著增生，新生肉芽组织形成，滑膜细胞由1～3层增至6～30层，以中性粒细胞、巨噬细胞、CD4+淋巴细胞为主。4周后关节出现软骨的侵蚀和骨的破坏，软骨细胞坏死并出现纤维化、软骨下新骨形成，终致关节变形。光镜下可见滑膜细胞大量增殖，排列不整齐，炎细胞大量浸润，纤维组织增生。该模型[25]是在皮下反复注射抗原，刺激家兔产生大量抗体，注入同一抗原后产生抗原-抗体-补体3(C3)免疫复合物，此复合物不仅在关节局部产生炎症反应，还可以介导T细胞的免疫反应，使得滑膜炎持续存在，滑膜增生，血管翳形成，侵犯软骨后导致其变性和降解。卵蛋白诱导的关节炎模型适合较大的关节进行研究，病理形态学改变和人的类风湿关节炎相似，而且这种动物模型对抗风湿和抗炎药物的反应性也与人RA相似，但该模型的免疫学特征及病程变化与人RA有一定的差异，因此应用该模型研究RA 有其特定的局限性。

4 病证结合模型

辨证论治是中医的基本原则，证候是对疾病过程中病因、病性、病位、病势的概括，证候是中医辨证论治的基础，是中医药干预的主体。因此，证候动物模型是中医药开发研究的载体，研制出符合中医证候的动物模型可真实反映中医药的功效和优越性[26]。病证结合模型以西医致病原理为基础，将宏观与微观、整体论与分析论相结合，在证候生物学基础未阐明的情况下是较为合适的研究模式[27]。

4.1 风寒湿痹证模型

中医学认为风寒湿邪气是痹证发病的外在条件，邪正交争剧烈时RA出现关节红肿热痛的症状，热邪是RA急性期的临床反映，但很快就会消退。王安民等[28]将大鼠放入冷水中游泳后再制作胶原诱导性关节炎模型，建立了风寒湿痹证动物模型，发现中性粒细胞、巨噬细胞等炎性细胞浸润性增加。肖长虹等[29]用玻璃铝合金自制造模箱，用空调机控制箱体内温度，雾化器使湿度维持在100%，风寒湿刺激温度7～10℃，风速18m/s，转速4次/min，在此基础上给予CIA造模，同时在关节面上涂擦葡萄球菌肠毒素B(SEB)，发现在SEB外抹前提下，风寒湿刺激可升高RF、免疫球蛋白G(IgG)的含量，增加雄性CIA大鼠炎症积分，表明痹证的发病条件不仅包括风寒湿等邪气刺激，还包括感染源或感染产物的存在，提示风寒湿CIA协同SEB可作为风寒湿痹证的模型。姜辉等[30]在大鼠右后足跖皮内注射CFA 0.1mL，予以4级风力，5～7℃冰水中站立20min造模。金祝秋等[31]发现风寒湿痹证大鼠模型踝关节组织中前列腺素2(PGE2)的含量明显比正常大鼠升高，并与关节肿胀呈正比。

4.2 脾虚证痹证模型

杜中平等[32]在大鼠腹腔注射利血平0.5mg/(kg·d)的基础上加以Ⅱ型胶原诱发脾虚痹证的模型。研究发现大鼠出现精神疲惫，被毛干枯无光泽，蜷缩扎堆，活动量和饮食减少，体重下降，便质清稀等类似脾虚的症状，脾虚证CIA大鼠关节损伤程度和关节红肿程度均显著加重，炎性指标如IL-6、IL-10、IFN-γ、抗Ⅱ型胶原抗体含量明显升高，表明脾虚证RA病证结合模型，能在一定程度上反映脾虚证RA患者的临床特征，且造模方法简便，操作性高，可为脾虚证痹证模型提供有利的参考依据。肖诚等[33]以大黄煎液25mL/(kg·d) 灌胃泻下，加饥饱失常法制造脾虚模型，继而予以Ⅱ型胶原免疫诱发CIA模型。结果显示，脾虚证痹证大鼠体重明显下降，出现纳差、泄泻症状，血清IFN-γ、 TNF-α含量明显升高，病理切片观察到滑膜明显增生，周围软组织存在大量炎性细胞浸润，血管翳形成，软骨出现退行性变。

4.3 肾虚证痹证模型

王燕等[34]分别采用去势法(即摘除双侧卵巢与睾丸)和羟基脲法375mg/(kg·d)灌胃制作肾虚动物模型，然后在尾根部皮下注射O型胶原与不完全弗氏佐剂混合物的方法诱导关节炎。两种肾虚证痹证大鼠均出现精神萎靡，反应迟钝，体毛稀少，喜扎堆，大便清稀，肛周污秽等与肾虚相似的临床症状，IL-6、IL-10及IFN-C水平均较CIA组明显升高，肾虚CIA大鼠肾上腺环腺苷酸(cAMP)与环鸟苷酸(cGMP)比值明显降低，抗O型胶原抗体含量明显升高。

5 结语

RA是由T细胞介导的自身免疫性疾病，目前RA动物模型研制趋向于某一特定的因素，难以复制出与人RA 完全一致的动物模型。病证结合动物模型是RA在今后中医药研究中发展的必然方向，目前病证结合动物模型只是简单的几种因素的叠加，尚缺乏统一的造模方法和明确的造模效果判断标准，因此需要借鉴现代医学的方法，在中医理论指导下模拟中医的病因、病性、病位、病势，构建符合西医“病”和中医“证”的病证结合模型，为今后RA的研究提供更可靠的疾病模型。

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(责任编辑：宋勇刚)

Advances in Animal Models with Rheumatoid Arthritis in TCM

Zhang Xinghua1，Du Xiaozheng1*，Wang Jinhai2，Yuan Bo1，Tian Liang1，Zhu Bowen1

(1.Gansu College of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730000， China;2.Department of Traditional Chinese Medicine ,The Second Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730000, China)

Rheumatoid arthritis (rheumatoid arthritis, RA) is a autoimmune disease characterized by chronic synovitis . it is difficult to prevent and cure it,animal models is an important part of medical research，so selecting the pathogenesis of human RA similar animal model is particularly vital for research. In order to provide experimental model reference for RA study， this article summarizes animal models of rheumatoid arthritis (RA) for experimental studies in recent years.

Rheumatoid Arthritis; Animal Model; Disease and Syndrome

2015-01-22

国家自然科学基金项目(81260558)；甘肃省自然科学基金项目(1208RJZA185)；甘肃省属高校基本科研业务费专项资金(2012-4)

张星华(1991-)，女，甘肃中医学院硕士研究生，研究方向为传统针刺手法治疗免疫系统疾病。

杜小正(1973-)，男，甘肃中医学院副教授，硕士生导师，研究方向为传统针刺手法治疗免疫系统疾病。Email：lz-duxiaozheng@163.com

R255.6

A

1673-2197(2015)12-0047-04

10.11954/ytctyy.201512018