PP1靶调节亚基的研究进展

杜　玥，赵　芳(综述)，雷　红(审校)

(武汉大学中南医院心内科，武汉430071)



PP1靶调节亚基的研究进展

杜玥△，赵芳(综述)，雷红※(审校)

(武汉大学中南医院心内科，武汉430071)

摘要：蛋白磷酸酶1靶调节亚基(PNUTS)是主要位于细胞核内广泛表达的蛋白质，其编码基因位于染色体6P21.3,容易突变。既往的研究发现，在哺乳动物细胞中PNUTS作为蛋白磷酸酶1(PP1)靶调节亚基，与PP1稳定的结合，并调节其催化活性，在细胞有丝分裂不同时期与染色质共定位，通过调控多种靶分子参与细胞的增殖与凋亡。有关PNUTS的研究现已迅速成为生命科学领域研究的热点。近年来研究发现PNUTS在细胞凋亡、肿瘤形成、衰老、心血管疾病发生发展等方面起着重要的作用。

关键词：蛋白磷酸酶1靶调节亚基；蛋白磷酸酶1；细胞凋亡；肿瘤；衰老

Senescence

蛋白磷酸酶1靶调节亚基(protein phosphatase 1 nuclear-targeting subunit，PNUTS)也称PPP1R10、CAT53、P99，是主要位于哺乳动物细胞核内广泛表达的蛋白质[1]，其编码基因位于染色体6p21.3，易突变，与遗传性血色病有关[2]。含量最高的是睾丸、大脑与肠道[3]。丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶1是细胞内主要的蛋白磷酸酶，它通过改变蛋白激酶的活性从而调节细胞分裂、肌肉收缩、基因表达、糖原代谢、神经传递等生理过程[4-5]。最初发现PNUTS在哺乳动物细胞内作为蛋白磷酸酶1的靶向亚基与蛋白磷酸酶1α、蛋白磷酸酶1γ形成稳定的复合物[6-8],进而调节蛋白磷酸酶1催化活性。PNUTS不仅在分子与细胞水平有着广泛的研究及作用，近年来发现，其在器官与整体水平也参与多种疾病的发生、发展。现对PP1靶调节亚基的研究进展进行综述。

1PNUTS结构

PNUTS结构中含有几个有功能的区域[7,9-11]：含CX8CX5CX3H的锌指结构，此结构同样存在于应答基因Nup475/Tis11家族中，可能参与细胞增殖与凋亡调控；N端转录延长因子S-Ⅱ，参与转录启动、RNApolⅡ延长。主要序列分析显示PNUTS在其C端结构有富含组氨酸和甘氨酸的密集排列的RGG序列模体[12]，而此模体同样存在于RNA结合蛋白中，通过RNA结合珠可将PNUTS-蛋白磷酸酶1复合物从哺乳动物细胞裂解物中分离出，且PNUTS与多聚A、G有较高结合力[13]，因此PNUTS可通过RGG序列模体与多聚A、G结合进而调节转录过程，以上结果表明，在哺乳动物细胞核中PNUTS在调节蛋白磷酸酶1与RNA相关复合物连接中起着重要作用。

2PNUTS的生物学功能及其机制

2.1PNUTS参与细胞缺氧应答调控多种细胞系中都可检测到PNUTS的存在和编码PNUTS的信使RNA，并且在缺氧环境下，它们的表达量显著增多。许多病理条件都会导致缺氧的发生。Lee等[14]通过实验发现，在缺氧或去铁胺环境下，PNUTS在鼠脑内皮细胞和人胚肾293 细胞表达量较非缺氧对照组明显上调，并且PNUTS的过表达增加了缺氧诱导的细胞死亡。启动子分析证实，在编码PNUTS基因的启动区域有缺氧反应元件的存在，它在缺氧条件下表达缺氧诱导因子α。这表明编码PNUTS的基因是一种新的缺氧诱导基因，它使细胞在缺氧环境下更易死亡。

既往研究已证实，缺氧能够促进p53富集与活化[15]，p53在缺氧诱导的细胞死亡机制中占有主要作用[16]。最近发现PNUTS还能增强p53的核定位、磷酸化与转录活性，活化的p53通过转录激活一些靶基因,如bax、puma、Bnip3L等诱导细胞发生凋亡。另外，PNUTS的过表达能促进原癌基因鼠双微基因2(murine double minute 2，MDM2)与p53分离，促进MDM2自动泛素化，诱导MDM2的降解[14]。MDM2是p53的E3连接酶，可以导致p53的泛素化修饰并被蛋白酶体降解。这些结果表明，在缺氧条件下，PNUTS可通过调节p53相关基因的表达来促进细胞死亡。

2.2PNUTS参与细胞周期与凋亡的调控在离体条件下，PNUTS依赖蛋白磷酸酶1增强染色体解聚。Landsverk等[17]通过免疫荧光试验对海拉细胞周期观察发现，PNUTS通过模体与蛋白磷酸酶1连接后，可作为蛋白磷酸酶1的靶向亚单位促进染色体解聚，模体基因突变或模体被蛋白激酶A磷酸化都会阻断体外连接过程。这种作用说明，PNUTS作为蛋白磷酸酶1全酶的一部分参与细胞的有丝分裂，如染色体解聚、纺锤体形成。在分裂间期，PNUTS与蛋白磷酸酶1分离，与染色质紧密连接。在有丝分裂末期重组核膜后，PNUTS靶向作用于重组细胞核，构成一个信号事件，促进下一周期有丝分裂间期染色体分离，并且发现在G1、S、G2、M期都有PNUTS的合成。PNUTS促进染色体解聚需要蛋白磷酸酶1与一个有功能的模体，但是如果抑制蛋白磷酸酶1结合位点对其解聚并无影响，这说明，在细胞核重建过程中，PNUTS并不是作为一种抑制剂来抑制蛋白磷酸酶1活性。Lee等[14]通过诱导细胞株使蛋白磷酸酶1与缺陷PNUTS结合，或在HEK239细胞中用小干扰RNA耗竭PNUTS，将导致细胞周期停滞在有丝分裂结束，染色质变为异常，最终导致凋亡细胞死亡。然而，还没有试验证明在人体内生理环境下PNUTS是如何影响染色体动态，也没有研究PNUTS在有丝分裂早期阶段对染色体形态产生的影响。

另外，De Leon等[18]发现，PNUTS参与Retinoblastoma (Rb)依赖型细胞凋亡的调节。在乳腺癌、直肠癌、卵巢癌细胞敲除PNUTS会激活Rb磷酸酶,进而导致转录因子E2F1从Rb释放出来，而E2F1能以非依赖p53形式激活胱天蛋白酶的活性[11，19-20]，进而促进细胞凋亡。更进一步的研究发现，Hs578T乳腺癌细胞经过阿糖胞苷治疗后PNUTS从蛋白磷酸酶1酶丢失，Rb去磷酸化[21]。所以，通过PNUTS-Rb途径也可以调节细胞凋亡，在促凋亡治疗中，PNUTS可作为潜在的靶点。Huang等[22]发现，在人睾丸胚胎癌细胞中，miR-383通过靶向损耗PNUTS，诱导细胞周期停滞，进而抑制组蛋白2A变异体磷酸化，由于组蛋白2A变异体除了在DNA损伤修复中发挥重要作用，也在VDJ重组、精子减数分裂和性小体失活过程中必不可少，所以，此研究说明PNUTS参与miR-383 介导的男性不育患者精子形成过程中的DNA损伤，通过调节PNUTS的表达降低DNA损伤反应，有可能治疗男性不育症。

2.3PNUTS参与肿瘤的发生发展Kavela等[23]发现，PNUTS在食管鳞状细胞癌和腺癌中表达较正常组织上调，且无论在肿瘤(食管癌、结肠癌、乳腺癌[24]、胰腺癌)还是正常组织中,PNUTS与第10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)含量呈正相关。PTEN是近年来新发现的一种肿瘤抑制基因,其产物PTEN蛋白具有蛋白磷酸酶活性和脂质磷酸酶活性。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/PKB)通路为体内主要的生存信号通路，激活后可通过催化多种蛋白质磷酸化而促进肿瘤细胞生长,抑制凋亡[25]。研究表明，在细胞核内PTEN可通过其脂质磷酸酶活性使PI3K的下游靶分子磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸脱磷酸，从而阻断PI3K/AKT信号通路来实现其抗肿瘤作用[26]。PTEN-PI3K/AKT信号转导通路失衡后，一方面会促进肿瘤的发生与进展,另一方面还可参与肿瘤的免疫逃逸[27]。近年来发现，PNUTS通过靶向作用于PTEN的脂质结合域(C2区域)而将PTEN分离出细胞核，阻断下传功能，从而积极调节PI3K/AKT信号通路，发挥其促进肿瘤细胞发生与发展,调控内皮、血管生成等作用。以上机制表明，通过与PTEN作用，PNUTS扮演着潜在原癌基因的角色[23]。

2.4PNUTS参与衰老过程Kim等[28]全基因组目标分析实验表明，PNUTS通过模体与端粒末端重复序列结合因子2(telomeric repeat binding factor,TRF2)结合降低端粒缩短。TRF2是一种端粒结合蛋白，可以重塑端粒DNA的T环结构，保护3′末端单链G尾不被DNA外切酶、连接酶识别，进而维持端粒DNA结构稳定、防止染色体端-端融合、参与细胞增殖、分化、凋亡及衰老过程。此外，它还可以作为一种枢纽蛋白，通过线性序列码招募不同的信号分子来调节端粒[29-31]。TRF2与模体结合对维持端粒的稳定起着重要的作用。

Landsverk等[32]发现，DNA损伤促进PNUTS移位到损伤处并在G2-M检查点修复双链DNA。在未受干扰细胞用小干扰RNA抑制PNUTS表达能激活G2期检查点，而在电离辐射诱导的DNA损伤后延长G2期检查点，激活细胞周期检测点激酶1。Landsverk更进一步用增强绿色荧光蛋白标记PNUTS发现，DNA损伤后大量PNUTS迅速并短暂地集中于DNA损伤位点，抑制G2期阻滞。并且，电离辐射后，缺乏PNUTS的细胞克隆存活率下降。以上研究说明，PNUTS通过降低端粒缩短，减轻DNA损伤，从而延缓衰老。

2.5PNUTS参与心血管疾病的发生发展心肌是最容易发生缺血/再灌注损伤的组织，目前的观念认为，心肌缺血/再灌注损伤的发生与细胞凋亡、白细胞作用以及自由基、钙、pH等的反常有关[6]。细胞凋亡又称细胞程序性死亡，是由体内外因素触发细胞内死亡程序而导致的细胞自主的有序的自然死亡过程。在心肌细胞凋亡过程中，PNUTS是其关键性元件，其异常表达可引起心肌细胞凋亡，并导致心肌衰老[33]。

Boon等[34]通过实验发现，老龄实验小鼠(18～20月龄)较幼龄鼠(6～8周)心肌细胞内PNUTS表达量高，且通过蛋白印迹方法证实了在小鼠心肌细胞中PNUTS的水平能被miR-34a下调。他们在荧光素酶基因序列下游接入PNUTS的3′-UTR 从而构建了一个新的可表达的报告基因。载入miR-34a后发现，荧光素酶的活性被抑制，但对3′-UTR内的miR-34a结合区域中有突变的报告基因无影响。相反，抑制miR-34a的表达将增强荧光素酶的活性，基于反转录酶法的实验也证明，miR-34a与PNUTS的3′-UTR相结合。从而证明了PNUTS是miR-34a直接作用的靶点。

此研究进一步发现，用慢病毒导入鼠体内使之超表达PNUTS，此时心肌细胞内由H2O2诱导的凋亡显著下降，由miR-34a介导的增强细胞凋亡的作用消除，说明PNUTS能抑制心肌细胞凋亡；实验还发现，通过腺病毒介导基因转染技术，使心肌组织中高表达PNUTS，结果显著改善小鼠心肌梗死后心肌收缩力的下降[34]。

已发现，miR-34a在心脏中的水平是最高的，在人体及鼠心肌细胞内miR-34a的表达量与年龄呈正相关，通过抑制miR-34a的表达可以减少心肌细胞的凋亡。其中，更深入的动物实验发现，小鼠急性心肌梗死后miR-34a表达量明显增加，对其行Antagomir-34a 治疗2 周后，观察到小鼠心脏的射血分数及心室壁运动相关参数均有改善。Zhao等[35]发现，高糖能诱导H9c2心肌细胞高表达miR-34a，并导致细胞凋亡。由于PNUTS是miR-34a直接作用的靶点，且通过PNUTS的降低端粒缩短，减轻DNA损伤反应作用抑制心肌细胞凋亡，因此可推测，PNUTS在糖尿病心肌病发生、发展中起着重要作用，而且miR-34a-PNUTS可能是缺血性心脏病进程的一条通路。增强PNUTS的表达可在诱导梗死心肌的恢复、保护缺血事件后心脏功能的过程中发挥作用，将PNUTS的诱导措施引入缺血性心脏病的治疗无疑是一个新亮点。

3展望

基础和临床研究均显示,PNUTS在肿瘤、心血管疾病的发生与发展中发挥重要作用。虽然根据PNUTS的各种作用机制进行临床治疗在理论上是可行的，但目前的研究距临床应用还有相当长的路要走。例如，PNUTS表达是否稳定，其表达水平受何种因素干扰等还少见报道。相信随着对PNUTS研究的不断深入，其与心血管疾病、肿瘤，甚至与其他疾病的关系和具体机制将逐渐被阐释，有望将PNUTS从分子生物水平工具转化为临床手段，进而为疾病的防治提供新的靶点。

参考文献

[1]Jagiello I,Beullens M,Stalmans W,etal.Subunit structure and regulation of protein phosphatase-1 in rat liver nuclei[J].J Biol Chem,1995,270(29):17257-17263.

[2]Narayanan S,Ruma D,Gitika B,etal.Antioxidant activities of seabuckthorn (Hippophae rhamnoides) during hypoxia induced oxidative stress in glial cells[J].Mol Cell Biochem,2005,278(1/2):9-14.

[3]Ciurciu A,Duncalf L,Jonchere V,etal.PNUTS/PP1 regulates RNAPII-mediated gene expression and is necessary for developmental growth[J].PLoS Genet,2013,9(10):e1003885.

[4]Lee SJ,Lee JK,Maeng YS,etal.Langerhans cell protein 1 (LCP1) binds to PNUTS in the nucleus:implications for this complex in transcriptional regulation[J].Exp Mol Med,2009,41(3):189-200.

[5]Loffredo FS,Pancoast JR,Lee RT.Keep PNUTS in your heart[J].Circ Res,2013,113(2):97-99.

[6]Yellon DM,Hausenloy DJ.Myocardial reperfusion injury[J].N Engl J Med,2007,357(11):1121-1135.

[7]Allen PB,Kwon YG,Nairn AC,etal.Isolation and characterization of PNUTS,a putative protein phosphatase 1 nuclear targeting subunit[J].J Biol Chem,1998,273(7):4089-4095.

[8]Rose M,Dütting E,Schr?der N,etal.PNUTS forms a trimeric protein complex with GABA(C) receptors and protein phosphatase 1[J].Mol Cell Neurosci,2008,37(4):808-819.

[9]Kim YM,Watanabe T,Allen PB,etal.PNUTS,a protein phosphatase 1 (PP1) nuclear targeting subunit.Characterization of its PP1-and RNA-binding domains and regulation by phosphorylation[J].J Biol Chem,2003,278(16):13819-13828.

[10]Jerebtsova M,Klotchenko SA,Artamonova TO,etal.Mass spectrometry and biochemical analysis of RNA polymerase Ⅱ:targeting by protein phosphatase-1[J].Mol Cell Biochem,2011,347(1/2):79-87.

[11]Choy MS,Hieke M,Kumar GS,etal.Understanding the antagonism of retinoblastoma protein dephosphorylation by PNUTS provides insights into the PP1 regulatory code[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2014,111(11):4097-4102.

[12]Burd CG,Dreyfuss G.Conserved structures and diversity of functions of RNA-binding proteins[J].Science,1994,265(5172):615-621.

[13]McAvoy T,Allen PB,Obaishi H,etal.Regulation of neurabin I interaction with protein phosphatase 1 by phosphorylation[J].Biochemistry,1999,38(39):12943-12949.

[14]Lee SJ,Lim CJ,Min JK,etal.Protein phosphatase 1 nuclear targeting subunit is a hypoxia inducible gene:its role in post-translational modification of p53 and MDM2[J].Cell Death Differ,2007,14(6):1106-1016.

[15]Graeber TG,Peterson JF,Tsai M,etal.Hypoxia induces accumulation of p53 protein,but activation of a G1-phase checkpoint by low-oxygen conditions is independent of p53 status[J].Mol Cell Biol,1994,14(9):6264-6277.

[16]Hammond EM,Giaccia AJ.The role of p53 in hypoxia-induced apoptosis[J].Biochem Biophys Res Commun,2005,331(3):718-725.

[17]Landsverk HB,Kirkhus M,Bollen M,etal.PNUTS enhances in vitro chromosome decondensation in a PP1-dependent manner[J].Biochem J,2005,390(Pt 3):709-717.

[18]De Leon G,Sherry TC,Krucher NA.Reduced expression of PNUTS leads to activation of Rb-phosphatase and caspase-mediated apoptosis[J].Cancer Biol Ther,2008,7(6):833-841.

[19]Afshar G,Jelluma N,Yang X,etal.Radiation-induced caspase-8 mediates p53-independent apoptosis in glioma cells[J].Cancer Res,2006,66(8):4223-4232.

[20]Pützer BM,Stiewe T,Parssanedjad K,etal.E1A is sufficient by itself to induce apoptosis independent of p53 and other adenoviral gene products[J].Cell Death Differ,2000,7(2):177-188.

[21]Krucher NA,Rubin E,Tedesco VC,etal.Dephosphorylation of Rb (Thr-821) in response to cell stress[J].Exp Cell Res,2006,312(15):2757-2763.

[22]Huang H,Tian H,Duan Z,etal.microRNA-383 impairs phosphorylation of H2AX by targeting PNUTS and inducing cell cycle arrest in testicular embryonal carcinoma cells[J].Cell Signal,2014,26(5):903-911.

[23]Kavela S,Shinde SR,Ratheesh R,etal.PNUTS functions as a proto-oncogene by sequestering PTEN[J].Cancer Res,2013,73(1):205-514.

[24]De Leon G,Cavino M,D′Angelo M,etal.PNUTS knockdown potentiates the apoptotic effect of Roscovitine in breast and colon cancer cells[J].Int J Oncol,2010,36(5):1269-1275.

[25]毕蕾,陈卫平,陈建平,等.丹酚酸A调控PTEN_PI3K/AKT信号通路对人肺癌细胞增殖的影响[J].南京中医药大学学报,2012,28(6):541-543.

[26]陈培.胃癌中PTEN与B7-H1蛋白表达的相关性及机制研究[D].郑州：郑州大学,2009.

[27]Cheng GZ,Park S,Shu S,etal.Advances of AKT pathway in human oncogenesis and as a target for anti-cancer drug discovery[J].Curr Cancer Drug Targets,2008,8(1):2-6.

[28]Kim H,Lee OH,Xin H,etal.TRF2 functions as a protein hub and regulates telomere maintenance by recognizing specific peptide motifs[J].Nat Struct Mol Biol,2009,16(4):372-379.

[29]Cesare AJ,Kaul Z,Cohen SB,etal.Spontaneous occurrence of telomeric DNA damage response in the absence of chromosome fusions[J].Nat Struct Mol Biol,2009,16(12):1244-1251.

[30]Jin K,Xiang Y,Tang J,etal.miR-34 is associated with poor prognosis of patients with gallbladder cancer through regulating telomere length in tumor stem cells[J].Tumour Biol,2014,35(2):1503-1510.

[31]Kurth I,Gautier J.Origin-dependent initiation of DNA replication within telomeric sequences[J].Nucleic Acids Res,2010,38(2):467-476.

[32]Landsverk HB,Mora-Bermúdez F,Landsverk OJ,etal.The protein phosphatase 1 regulator PNUTS is a new component of the DNA damage response[J].EMBO Rep,2010,11(11):868-875.

[33]Dorn GW 2nd.miR-34a and the cardiomyopathy of senescence:SALT PNUTS,SALT PNUTS![J].Cell Metab,2013,17(5):629-630.

[34]Boon RA,Iekushi K,Lechner S,etal.MicroRNA-34a regulates cardiac ageing and function[J].Nature,2013,495(7439):107-

110.

[35]Zhao F,Li B,Wei YZ,etal.MicroRNA-34a regulates high glucose-induced apoptosis in H9c2 cardiomyocytes[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2013,33(6):834-839.

Research Progress of Phosphatase 1 Nuclear-Targeting SubunitDUYue,ZHAOFang,LEIHong. (DepartmentofCardiology，ZhongnanHospitalofWuhanUniversity，Wuhan430071,China)

Abstract:Phosphatase 1 nuclear-targeting subunit (PNUTS) is a ubiquitously expressed protein and its coding gene is on chromosome 6P21.3,with easy mutation.Previous studies have found that PNUTS functions as a nuclear regulatory subunit of PP1,forms a stable complex with PP1 and regulates PP1 catalytic activity in mammalian cells.PNUTS os colocalized with chromatin at distinct phases during mitosis,involved in cell proliferation and apoptosis by regulating various target molecules.Research related to PNUTS is now a hotspot in the field of life science.Recent studies have found that PNUTS plays an important role in the development of apoptosis,tumorigenesis,senescence,cardiovascular diseases and other physiological contexts.

Key words:Protein phosphatase 1 nuclear-targeting subunit; Protein phosphatase 1; Apoptosis; Tumor;

收稿日期：2014-08-25修回日期：2014-11-24编辑：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.13.012

中图分类号：R54;R73

文献标识码:A

文章编号：1006-2084(2015)13-2335-03