新型缺氧保护因子胞红蛋白的研究进展

李 维，范文静综述，屈顺林审校

0 引 言

珠蛋白家族是一类有着相似一级结构和三级结构的蛋白质，均含有血红素辅基。作为呼吸链蛋白之一，珠蛋白可通过铁卟啉环和组氨酸多肽链来与氧分子结合［1］。研究表明，脊椎动物中有多种结构、功能和组织分布不同的珠蛋白。目前，在脊椎动物中，已知的且被正式命名的珠蛋白类型有4 种:血红蛋白、肌红蛋白、脑红蛋白和胞红蛋白。其中，胞红蛋白是由Kawada 等［2］于2001 年运动蛋白质组学方法研究大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)激活的分子机制时发现的一种肝星状细胞激活相关蛋白。文中主要就珠蛋白家族中的胞红蛋白的生理特征及功能作一综述。

1 珠蛋白家族简介

珠蛋白是一类小分子金属类蛋白质，通常由150个氨基酸组成［3］，有8 个α-螺旋(命名为A-H)呈现出典型的三明治夹心α-螺旋折叠结构［1］。这种保守的“珠蛋白折叠”结构是珠蛋白超家族所特有的。珠蛋白均含有血红素辅基(铁卟啉环)，能够可逆的与氧气、一氧化碳和一氧化氮结合［4］。在动植物演化进程中，珠蛋白很早就出现了，并且普遍存在于细菌、真菌、植物、无脊椎动物和脊椎动物中。起初，认为血红蛋白和肌红蛋白是脊椎动物中仅有的两种珠蛋白。然而，随后的相关研究和报道推翻了这一说法，随着脑红蛋白和胞红蛋白的相继发现，研究人员又于2005年在低等脊椎动物中发现了珠蛋白家族中的第五位成员，但因其功能不明，暂且称其为X 珠蛋白［5］。根据脊椎动物珠蛋白序列特征分析发现，胞红蛋白和肌红蛋白有30%同源性，起源于同一进化分支，“祖先蛋白”分化为两支，一支特异性的分布于神经系统而进化成脑红蛋白，另一支则分布于全身而进化成为了血红蛋白、胞红蛋白和肌红蛋白［1］。在人类和脊椎动物中，血红蛋白主要位于红细胞中，然后通过呼吸系统将呼吸器官中的氧气运送到组织中，将组织中的二氧化碳运送到呼吸器官从而排出体外［6］。脊椎动物中，单体结构的肌红蛋白主要作用是存储氧气以及促进细胞内的氧气扩散至线粒体。

2 胞红蛋白的结构和分布

胞红蛋白是一类小的呼吸蛋白，广泛表达于生物体中。人的胞红蛋白定位于17q25.3 染色体片段上，含有3 个内含子和4 个外显子［7］。根据已发现的肌红蛋白的生理功能，可推断出胞红蛋白的某些生理功能。与其他珠蛋白相比，哺乳动物胞红蛋白通常较长，约有190 个氨基酸，其三级结构表现出典型的三明治夹心α-螺旋折叠结构，相对分子质量为21 000［2］;中间为蛋白核心区域，具有携氧珠蛋白结构和功能意义的关键性残基如PheCD1、HisE7、HisE8 等［8］;在其N-末端和C-末端约有20 个氨基酸的延伸。胞红蛋白中包含2 个半胱氨酸，分子内存在二硫键［9］。二硫键的断裂可能会降低胞红蛋白的氧亲和力。

多项研究表明哺乳动物的胞红蛋白在各组织及各发育阶段均有表达，如大脑、心脏、肝、肺等。不同组织中的胞红蛋白水平不同，且浓度均相对较低。最近的一些研究利用免疫组织化学、Western Blot 等方法检测各种器官中胞红蛋白的表达，发现胞红蛋白更多的表达于结缔组织的成纤维细胞以及和成纤维细胞相关的细胞系中，如软骨细胞、成骨细胞、HSCs 和肌成纤维细胞［10］。然而，一些研究表明在神经元细胞、肌细胞、肝实质细胞和上皮细胞中也有胞红蛋白的表达［11］。这些均说明了胞红蛋白广泛表达于各个器官中。成纤维细胞中的胞红蛋白主要分布在细胞质中，而神经元细胞中的胞红蛋白既表达于细胞核中，又表达于细胞质中［12］。胞红蛋白在中枢神经系统内分布广泛，其中在海马、丘脑和下丘脑中表达显著，而这三个区域能够感应缺氧应激，表明胞红蛋白可能在缺氧损伤中起到重要作用［13］。最近，有研究发现人骨髓组织和孤束核(nucleus of the solitary tract，NTS)中也有胞红蛋白的表达。胞红蛋白在NTS 中作为一种“神经珠蛋白”发挥作用，为呼吸系统提供氧气的改变情况［14］。

3 胞红蛋白的生理功能

3.1 氧气的储存和运输以及氧传感器 胞红蛋白具有氧结合能力。因为与肌红蛋白的同源性，提出了胞红蛋白参与氧气的运输以及促进细胞内氧气的扩散。也有研究者认为胞红蛋白可以贮存氧气，微小的需氧环境能够促进还原剂(H+、NADH)的积累［15］，从而改变细胞的氧化还原状态，破坏胞红蛋白的二硫键结构，进而改变胞红蛋白的结构并释放氧气。胞红蛋白与氧气结合之后，其构象发生改变，进而关联信号传感器与氧感受器。如在细胞核中，胞红蛋白可能将信号传送到转录机制中，从而影响基因的表达。但是到目前为止，还未有证据表明胞红蛋白能够直接传递信号。

3.2 胞红蛋白与纤维化 器官纤维化是一种慢性病变过程，其显著特征之一就是胶原沉积［16］。在越来越严重的肝纤维化过程中，胞红蛋白的蛋白和mRNA 的表达量是逐渐增强的，说明胞红蛋白与肝纤维化之间可能存在一定的作用。正常生理情况下，HSCs 负责血流的控制以及维生素A 的储存。慢性肝损伤的情况下，被激活的HSCs 能够转化成肝成纤维细胞并促进细胞外基质沉积导致器官纤维化［17］。在纤维化的刺激下，胰腺星状细胞和肾间质细胞中的胞红蛋白表达增加，同时发现合成的胶原蛋白也增加。将胞红蛋白转染进NIH 3T3 细胞中发现与对照组相比细胞中胶原蛋白的生成量增加［18］。此外，缺氧能够上调胞红蛋白的表达，同时也能引起器官的纤维化，伤口愈合，骨生成和软骨形成，而这些过程均需要氧依赖性胶原蛋白的产生。然而在纤维化中，胞红蛋白还起到了一种保护作用。众所周知，胞红蛋白具有抗氧化应激的作用，同时在纤维化模型中胞红蛋白的过表达也被证明可抗氧化应激。胞红蛋白可清除组织损伤时产生的活性氧类(reactive oxygen species，ROS)，从而起到一定的保护作用［19］。近来有研究发现，在纤维化的患者肝中，胞红蛋白表达于HSCs 中，而在肌成纤维细胞中却无胞红蛋白的表达。由此可见，胞红蛋白可作为一种有效的标记物来区分损伤肝中的HSCs 和肌成纤维细胞［20］。

3.3 神经保护作用 在神经病变性过程中，胞红蛋白的上调可能与应激有关。视网膜内血流的不稳定会造成局部缺血，从而导致神经损伤和青光眼的发生发展［21］。有学者利用免疫组化检测5 例癫痫和/或精神性运动发育迟缓患者的大脑样本，发现2 例患者中就有1 例星状细胞内含物中的胞红蛋白呈阳性染色。神经元活动过度会引起能量、氧气以及血糖水平的降低，同时还会增加乳酸以及谷氨酸的浓度。神经元活动过度还会导致核转录因子κB(nuclear transcription factor，NF-κB)诱导的神经型一氧化氮合酶的上调以及一氧化氮的产生［22］，且可与过氧化物一起导致神经损伤［23］。因此推测，胞红蛋白的过表达可能是由氧化还原/氧气失衡诱导的，且极有可能是通过NF-κB 途径。综上所述，可认为胞红蛋白的神经保护作用主要是通过抗氧化应激作用来实现的。

3.4 胞红蛋白与癌症 人的17q 染色体上富含抑癌基因，基因敲除、基因过表达及胞红蛋白基因上、下游区域的分析表明位于此处的胞红蛋白基因具有抑癌活性［7］。对多种恶性肿瘤的研究已经证实胞红蛋白常发生基因失衡或基因沉默现象。首次证明胞红蛋白和癌症之间有遗传关联的是在胼胝症食管癌综合征中［24］。卵巢癌中，胞红蛋白的表达下调了，且有证据显示胞红蛋白可调节卵巢癌细胞的增殖和入侵能力［25］。最近有研究为肺癌中胞红蛋白基因甲基化显著增强提供了初步证据。通过对肺癌和乳腺癌细胞系以及支气管和乳腺上皮细胞系的特异性DNA 序列甲基化分析，证明了胞红蛋白的表达和启动子110 bp 区域富含CpG 岛的甲基化呈显著负相关［23］。研究发现，可利用活体组织和痰液样本进行胞红蛋白基因的甲基化分析，从而对肺癌患者进行诊断［26］。对于多种上皮细胞和血液细胞肿瘤的分析也证实了胞红蛋白基因甲基化分析的特异性作用。

3.5 胞红蛋白与肌肉再生 哺乳动物的骨骼肌能够改变、修复以及利用自身的卫星细胞达到再生。但成人骨骼肌的再生并不是不受限制的。肌祖细胞的减少通常被认为是进行性肌无力、伴有各种骨骼肌疾病的外围骨骼肌萎缩以及正常老化过程中的一个重要的促进因素［27］。在整个哺乳动物的生命周期中，骨骼肌的维持、适应以及修复均是依赖于肌细胞持续不断生成的能力。当肌肉出现损伤时，位于肌膜之间的肌祖细胞被激活并开始增殖。有研究证明缺氧能够诱导C2C12 成肌细胞(由肌祖细胞衍生而来的)中的胞红蛋白的表达［28］。有证据表明，胞红蛋白定位于肌祖细胞的细胞核中，并且在肌肉再生过程中有短暂的诱导表达。同时，胞红蛋白能够减轻由ROS 刺激的细胞凋亡。当肌祖细胞缺乏胞红蛋白的时候，该细胞的增殖和分化的能力就会受到影响，从而不能形成成熟的肌小管。当小鼠体内的胞红蛋白特异性缺失时，小鼠肌肉的修复和再生会受到严重损伤［29］。许多研究均表明，肌祖细胞的氧化还原状态是骨骼肌再生能力的主要决定因素，氧化状态下的肌祖细胞更易分化和出现细胞死亡，而还原状态下的肌祖细胞更易增殖并存活［30］。值得注意的是，研究人员发现在激活的肌祖细胞细胞核中出现了胞红蛋白和成肌分化抗原(myogenic differentiation antigen，MyoD)的共同活化［31］。在敲除胞红蛋白的小鼠中，用环磷酰胺诱导其产生骨骼肌损伤之后发现，虽然骨骼肌再生期间有MyoD 表达，但这一过程中却无肌细胞生成素的表达。总之，胞红蛋白能够促进肌祖细胞的存活，从而为肌肉的产生和骨骼肌的再生起关键作用。

4 胞红蛋白与缺氧

4.1 缺氧对胞红蛋白表达的影响 暴露于氧化剂下发现内源性的胞红蛋白表达显著提高。研究显示，用各种应激因素如过氧化氢、红藻氨酸、热休克和高渗透压处理可诱导神经母细胞瘤细胞N2a 胞红蛋白表达。过氧化氢处理也可上调MCF7 乳腺癌细胞株中胞红蛋白表达。在围产期缺氧缺血引起的脑损伤的情况下，发育的大脑中内源性胞红蛋白的mRNA 和蛋白表达量均上调［32］。

心脏疾病、癌症、脑血管疾病等是引起死亡的最常见的原因。在这些病症中，氧平衡的破坏是一个重要方面。即使是短暂的局部缺氧，也会产生不可逆的细胞损伤，尤其是那些有着较高代谢活动的组织。目前，越来越多的研究表明胞红蛋白与缺氧相关途径有关联。缺氧能够引起大多数动物以及组织中的胞红蛋白表达增加，实验已证明，缺氧能引起神经元HN33 细胞、转化的支气管上皮细胞BEAS-2b、子宫癌HeLa 细胞和多形性成胶质细胞瘤细胞株中胞红蛋白的表达上调［33］。在成神经细胞瘤缺血模型中显示，缺血能够诱导胞红蛋白的表达下调，而缺氧却能诱导胞红蛋白的表达上调［34］。缺氧能够促进头部、颈部、肝以及肾癌细胞株中胞红蛋白的表达上调。有研究表明，胞红蛋白的mRNA 水平升高是肿瘤组织缺氧的一个显著特征。而对于暴露在缺氧或缺血的细胞中，胞红蛋白表现出一种细胞保护作用［35］。将小鼠暴露在缺氧环境中发现在小鼠的心脏和肝中胞红蛋白上调了2 ～3 倍，这与胞红蛋白基因上保守的缺氧反应序列有关［36］。

4.2 缺氧影响胞红蛋白表达的机制 对胞红蛋白的基因结构进行研究之后发现，胞红蛋白启动子5'非编码区域内含有与调节氧平衡相关的重要转录因子——缺氧诱导因子［37］，5'和3'端非编码区域分别含有2 个保守的缺氧反应元件(hypoxic response elements，HRE)及2 个候补的HRE，3'端非编码区域另包含2 个缺氧诱导蛋白结合位点［38］，这个结合位点的模序被证实能够稳定各种缺氧应答基因的mRNA。许多涉及氧稳态的过程均由HIF 来调控，而HIF 又可转录介导数十种靶基因的表达。在不同的靶基因中已经证实，HRE 包含了HIF-1 发挥其功能必备的HIF-1 结合位点以及一段共有序列5'-RCGTG-3'［37］。胞红蛋白的启动子区域含有多种保守的HREs，说明在缺氧情况下胞红蛋白的表达上调。但是，胞红蛋白在缺氧下表达的具体机制，仍然有待进一步证明。

心室肥厚是心脏应对外界各种应激时所做的适应性应答。这种肥大可进一步增强心输出量以及心室壁的压力，进而导致适应性变差，最终导致心脏代偿失调和心脏衰竭［28］。在心室肥大中存在氧化还原状态、各种信号转导通路和应激反应性蛋白的改变。胞红蛋白是一种应激反应性血红素蛋白，体外实验证明胞红蛋白可结合氧气、一氧化氮以及自由基［39］，且胞红蛋白清除氧自由基的作用较其调节氧代谢的作用更加重要。但是目前，胞红蛋白的基因调控区还未得到充分的研究。然而，研究人员却发现其家族的另一位成员肌红蛋白的转录受到钙依赖性转录因子:活化T 细胞核因子(nuclear factor of activated T cells，NFAT)和激活蛋白AP-1(activator protein-1)的调控，由于胞红蛋白与肌红蛋白高度同源，因此就推测胞红蛋白可能和肌红蛋白相同，转录也受到钙依赖性转录因子NFAT 和AP-1 的调控。

体外和体内实验均已经证明，缺氧状态下，胞红蛋白的mRNA 和蛋白水平均得到上调。胞红蛋白基因的5'端上游有一个关键区域能够调节缺氧下胞红蛋白的转录。有发现缺氧下胞红蛋白转录的激活是由钙调磷酸酶介导的。钙调磷酸酶是一种重要的钙-钙调蛋白激活的磷酸酶，并且可通过参与各种心脏基因调节涉及的信号转导途径来调节心脏的生长/重构、肥大、细胞凋亡以及新陈代谢。当环境中存在应激反应时(如缺氧、局部缺血等)，钙-钙调蛋白激活钙调磷酸酶，使得肌细胞通过细胞中钙调磷酸酶改变各种转录因子(如AP-1、NFAT 等)以及基因表达的能力来应对外界的应激［28］。根据体外转录分析胞红蛋白启动子区域所得数据发现，在转基因小鼠模型中有不同程度的钙调磷酸酶的激活，在涉及抑制内源性钙调磷酸酶活性的实验中也清楚的证明了钙调磷酸酶能够调节肌细胞中胞红蛋白的转录激活。这些体外和体内实验均已证明，胞红蛋白的转录是受到钙调磷酸酶活性的影响的。尽管钙调磷酸酶能够通过改变各种转录因子来调节基因的转录，但其中钙调磷酸酶/NFAT 途径最为显著，尤其是在心脏重构以及心室肥大中。在调节胞红蛋白转录过程中可能存在NFAT 和AP-1 之间的相互作用。因为删除了保守的NRE 结合位点和抑制NFAT的活性的实验均证明NFAT 不是单独调节胞红蛋白的转录，可能是与AP-1 相互作用调节。首先，NFAT和AP-1 能直接结合到胞红蛋白的启动子区域，然后发挥协同作用一起调节胞红蛋白的转录。第二，NFAT 也有可能不是直接结合到胞红蛋白的启动子区域，而是先和AP-1 形成复合物，然后再结合到启动子区域并发挥调节转录的作用［28］。

5 展 望

综上所述，胞红蛋白结构特殊，广泛分布且具有多样的生理功能。随着时间的推移，科学的进步和发展，对于对胞红蛋白的研究也正日益深入。尤其是胞红蛋白的抗氧化应激作用，以及在缺氧条件下的保护作用，更是备受重视。鉴于氧气对生命的重要性，氧代谢一直是备受关注的研究领域。胞红蛋白的发现和深入研究无疑为临床代谢相关疾病的治疗及相关应用均提供了新的观点和思路。同时，胞红蛋白的其它生理功能的发现，无疑也是为许多疾病带来了新的希望。但是珠蛋白家族的研究还未结束，尤其是对胞红蛋白的研究还未结束，相信经过广大科研工作人员的不懈努力，在不久的将来，会有更多、更深入的功能研究应用于生活中，从而造福人类。

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