内质网应激在糖尿病肾病发病中的机制研究

李　芸(综述),席春生(审校)

(兰州军区兰州总医院肾脏内科,兰州 730050)

内质网应激在糖尿病肾病发病中的机制研究

李芸(综述),席春生※(审校)

(兰州军区兰州总医院肾脏内科,兰州 730050)

摘要：内质网应激(ERS)是内质网腔内错误折叠蛋白聚积的一种适应性反应。越来越多的证据表明，ERS可能是糖尿病肾病进展的重要机制之一。在糖尿病肾病的发展过程中，细胞内适宜的ERS作用可保护肾脏细胞免受高血糖等危险因素的损害，而程度过强或时间过长的ERS使细胞的保护机制不能与损伤作用抗衡，细胞内错误折叠的蛋白质在内质网中不断聚集，扰乱内质网的正常功能，从而使多个下游的细胞信号相关通路启动，诱导细胞凋亡发生，肾脏细胞不断死亡促进糖尿病肾病的进展。因此，ERS在糖尿病及其并发症脏器损害过程中的作用值得进一步研究。

关键词：糖尿病肾病;内质网应激;糖尿病

内质网是细胞内重要的细胞器，也是重要的钙离子贮存库。它调节细胞内蛋白质的合成后折叠与聚集、细胞对应激的反应以及细胞内钙离子的水平。目前研究认为，胰腺细胞、心肌细胞、神经元细胞所发生的内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)作用可能分别是糖尿病、心脑组织缺血梗死、退行性神经疾病等进展的重要原因[1]。ERS是指细胞受到内外因素的刺激时，内质网的形态、功能受到破坏后发生一系列生化结构改变，蛋白质加工运输的过程受阻，大量未折叠或错误折叠的蛋白质在内质网中形成，细胞会应激性地进入应答措施，缓解内质网功能障碍，促进蛋白质加工运输功能的恢复[2]。引发ERS的因素很多，缺血低氧、高葡萄糖血症、钙离子超载等可造成内质网的应激损伤[3]。现对内质网应激在糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)发病中的机制研究进展进行综述。

1ERS的生物学效应与信号通路

根据诱发原因，可将ERS分为以下3 种类型:①未折叠或者错误折叠蛋白质在内质网腔内蓄积引发的未折叠蛋白质反应(unfolded protein response，UPR)； ②内质网过度负荷反应通路，正确折叠的蛋白质在内质网腔内过度蓄积激活核因子κB诱导的细胞因子产生；③胆固醇缺乏引发的固醇调节元件结合蛋白质(sterol regulatory element binding protein，SREBP) 通路调节的反应[4]。前两者均是蛋白质加工紊乱所致，后者则是在内质网表面合成的胆固醇损耗所致，其信号通路及效应如下。

1.1UPR通路目前对UPR的机制研究较为深入。如果内质网腔中的钙离子排空、二硫键结合减少、突变蛋白质表达等，干扰蛋白质的合成和构象变化，就会导致内质网内积累大量错误折叠或未折叠蛋白质[5]，形成ERS，并启动UPR通路，UPR通过激活蛋白激酶R样内质网激酶 (PKR-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)、肌醇蛋白1和激活转录因子6 (activating transcription factor-6，ATF6)信号通路[6]，改变细胞的转录和翻译过程来缓解ERS。

1.1.1肌醇蛋白1信号通路的应答反应在神经元损伤时，肌醇蛋白1是启动ERS “分子伴侣” 葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein78，GRP78)表达的主要跨膜蛋白之一，具有蛋核酸内切酶的活性。在ERS时，通过激活核酸内切酶活性，活化的肌醇蛋白1通过与靶基因上的特定调控序列-ERS反应元件相结合，激活相关靶基因转录，上调分子伴侣的转录水平，促进错误折叠蛋白的构象校正[7]，使细胞对损伤因素产生适应性发应。肌醇蛋白1核酸内切酶的激活通过一种名叫调节肌醇蛋白1依赖衰解的作用，该过程涉及某些细胞的信使RNAs降解，其中包括胰岛素原信使RNA和肌醇蛋白1自身[8]。肌醇蛋白1能通过核糖核酸内切酶活性使肿瘤坏死因子受体相关因子2向内质网聚集，其结果是增加肌醇蛋白1的靶基因c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)活性。JNK属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可与p53蛋白、激活转录因子2等作用，在促凋亡和生长信号方面发挥作用。目前发现JNK可能还参与了ERS诱导的细胞自嗜，其研究依据包括：研究者通过电子显微镜分析细胞超微结构后发现，JNK能诱导细胞自嗜体的产生，将微管相关蛋白1轻链3-β绿色荧光染色后可见细胞内自嗜体密度明显增加；通过应用JNK抑制剂可以阻断自嗜因子Beclin-1的表达上调，从而减少自嗜体的发生[9-10]。

1.1.2ATF6信号通路的应答反应活化转录因子 ATF6 位于内质网膜上，是一个在信号转导系统中发挥着转录因子的重要功能蛋白，它的N端位于胞质,C端位于内质网内，是血清反应因子的结合蛋白，主要在细胞增殖调控中起激活作用[11]。在哺乳动物的细胞中，ATF6有ATF6α和ATF6β两种亚型，两者结构相似。ATF6和环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)反应元件结合蛋白具有相同的DNA结合序列(TGACGTCA)，即cAMP反应元件[12]。与此同时，ATF6和cAMP反应元件结合蛋白能形成异聚体调控基因的表达。ATF6作为信号感受蛋白可与内质网腔内分子伴侣蛋白GRP78结合形成复合物，平时处于无活性状态，当内质网中未折叠蛋白蓄积增加时，诱导GRP78和ATF6分离[13]，同时ATF6(90 000)将被转运至高尔基复合体，在高尔基体蛋白酶S1P、S2P蛋白酶的作用下对其跨膜片段进行切割，产生游离的50 Ku 的N端片段，即成熟的ATF6，活化的ATF6 N端切割段进入到细胞核内，结合于ERS反应元件，促进转录因子如核因子Y及UPR靶分子GRP78等的相互作用[14]，从而启动相关基因的表达，指导内质网膜伴侣分子和蛋白折叠所需要的酶蛋白基因的转录[15]。

1.1.3PERK信号通路的应答反应PERK 是内质网跨膜蛋白的一种，属丝/苏蛋白激酶，胞质区含有激酶结构域。一般状况下，PERK与分子伴侣GRP78结合，在应激时，两者分离，形成PERK同源二聚体，激酶结构域磷酸化后激活，与真核生物起始因子2(eukaryotic initiation factor 2，eIF2) 的α亚单位(eIF2α) 结合，eIF2ɑ的第51位丝氨酸发生磷酸化，这使起始信使RNA迅速减少，进而减缓了内质网腔内蛋白质的合成。应激细胞中PERK活化后能特异性地抑制细胞周期蛋白D1的翻译表达,导致G1期的停顿。同时PERK激活后还会激活JNK及P38信号转导通路,诱导UPR基因的转录。另外，磷酸化PERK/eIF2α可介导ATF4的信使RNA高表达。ATF4 属于CCAAT 增强子结合蛋白的转录因子，可以进入细胞的核内后，作用于下游相关基因，促进能量代谢、蛋白质分泌，从而降低细胞的应激程度，使细胞存活[16]；但程度较重，持续时间较长的ERS会激活CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白和DNA损伤诱导基因34等蛋白的表达，导致细胞的程序性凋亡[17-18]。

1.2内质网超负荷反应正确折叠的蛋白质在内质网过度储积，特别是因膜蛋白在内质网异常堆积也会启动其他促生存的机制来反制内质网压力。其中内质网超负荷反应是一相对独立的信号通路。它以激活核因子κB为主要特点，启动多种前炎性蛋白和细胞黏附分子的转录表达，可对细胞的凋亡进行调控。核因子κB的激活可能与ERS时钙贮存释放以及活性氧类产生有关[19]。

1.3固醇调节级联反应固醇调节级联反应是内固醇表面合成的胆固醇损耗所致，通过SREBP介导的信号途径，影响特定基因表达。ESR时，在内质网膜表面合成的胆固醇的耗竭激活SREBP，其与SREBP裂解激活蛋白形成复合物，进而被酶解成为转录因子进入胞核，与靶基因的固醇调节元件结合，增强靶基因转录[20]。

2DN中的ERS机制

DN是糖尿病引起的严重和危害性最大的一种慢性并发症，由糖尿病引起的微血管病变而导致的肾小球硬化，是本症的特点，也是导致终末肾衰竭的常见原因。发病机制复杂，涉及多种细胞生物学机制[21]。DN中有高血糖、氧化应激、脂质代谢异常等多种ERS的诱发因素，因此,ERS很可能在糖尿病肾组织损害过程中扮演重要角色[22]。深入探讨ERS在DN发病机制中的作用，会为DN 的研究提供新的防治思路。

研究提示ERS可通过调控氧化应激和炎症激活参与糖尿病和DN的发病过程。ERS因子PERK在胰腺中广泛高表达，PERK突变可致使胰岛素不能生成和胰腺β细胞衰竭，PERK缺失小鼠可出现β细胞为主的胰腺功能不全[23]。研究提示eIF2ɑ磷酸化的缺失可增加β细胞合成大量蛋白并促进蛋白折叠的需求，这也导致胰岛素原的折叠和错误折叠，加重了胰腺细胞的氧化应激。大量蛋白尿可引起ERS并参与小管间质性炎症的形成[24]。ERS和氧化应激在DN大鼠肾皮质和高糖刺激的肾小球系膜细胞显著激活，其强度随时间进展而进行性增强，应用分子伴侣4苯基丁酸干预ERS可降低应激水平，减轻氧化应激及炎症激活，抑制DN的发展[25]。研究表明，肾组织中GRP78水平的增高与ERS相关的增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein-homologous protein,CHOP)、JNK及caspase-12凋亡信号转导上调呈平行关系，提示过度ERS通过凋亡促进DN的进行性损伤[26]。

脂质在肾小球或肾小管上皮细胞内沉积是DN常见的病理变化。其中DN患者血液中游离脂肪酸(free fatty acids，FFAs)的水平显著高于正常人。FFAs不仅沉积在肾小球，也通过重吸收沉积在肾小管上皮细胞从而引起脂毒性损伤。脂肪型脂肪酸结合蛋白(adipocyte fatty acidbinding protein，A-FABP)是脂肪酸结合蛋白家族中最具特征的成员，它通过与脂肪酸结合，促进FFAs的转运，表达量与FFAs密切相关。研究提示DN患者肾活检组织肾小球的FABP4以及内质网分子GRP78、凋亡因子caspase-12表达增高、Bcl-2表达减少[27]，说明DN存在ERS，持续的ERS提高了 FABP4的表达并抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，促进系膜细胞的凋亡。

晚期糖基化终末产物参与了DN的进展。长期高血糖可导致晚期糖基化终末产物在体内过多蓄积，诱发细胞钙离子超载，上调 GRP78 表达[28]，同时激活ERS相关蛋白如肿瘤坏死因子受体相关因子2、CCAAT/ CHOP、JNK等因子，导致固有细胞凋亡[29]。晚期糖基化终末产物可呈时间和剂量依赖性上调足细胞ERS分子GRP78的表达[23]，维持细胞内质网结构和功能的平衡。

ERS相关的凋亡在DN中也发挥重要作用。研究提示GRP78、caspase-12在正常大鼠肾脏组织中少量表达，主要分布于肾脏内肾小球及肾小管细胞，糖尿病6周组GRP78、caspase-12在肾脏肾小球及肾小管细胞的表达量升高,糖尿病12周组表达量更高。结果表明ERS参与了DN的发病机制,肾脏细胞的ERS能力及相应的细胞凋亡随糖尿病病程延长而增强[30]。DN小鼠GRP78、p-PERK、磷酸化真核启动因子2α、CHOP表达水平显著增高，并伴有显著肾小球硬化和肾小管间质纤维化[31]；CHOP基因敲除的DN小鼠尿白蛋白水平显著降低，肾小球损伤和肾小管间质病变也相应减轻，表明调控CHOP转录活性对延缓DN的进程具有重要意义[32]。研究表明，白蛋白可激活ERS性的凋亡因子caspase-12，进而损伤肾小管上皮细胞引起凋亡。高糖及白蛋白刺激肾小管上皮细胞，诱导适应性UPR反应，以维持细胞的功能，持续的ERS会诱导细胞凋亡途径的激活[33]。

3结语

DN是糖尿病最严重的并发症之一,也是引起终末期肾病最主要的一个原因。ERS在糖尿病、胰岛素抵抗以及糖尿病相关血管并发症的发病机制中发挥重要作用。越来越多的研究表明，ERS在糖尿病及其并发症脏器损害过程中的作用值得进一步关注，其中一些证明了ESR是肾脏病的发病机制之一，并发现了一些之前未被认可的机制。因此,深入探讨ERS在DN发病过程中的作用,开发针对 ERS 过程中信号转导的关键点或分子靶标、筛选特异有效的抑制剂或激动剂有可能会为临床DN的防治提供新的治疗手段。

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Study on the Mechanism of Endoplasmic Reticulum Stress in Diabetic Nephropathy

LIYun,XIChun-sheng. (DepartmentofNephrology,LanzhouGeneralHospitalofChinesePLALanzhouCommand,Lanzhou730050,China)

Abstract:Endoplasmic reticulum stress(ERS) is an adaptive response to the accumulation of misfolded proteins in the endoplasmic reticulum.In recent years,increasing evidences have shown that ERS plays an important role in diabetic nephropathy.In the progression of diabetic nephropathy,moderate ERS can protect renal cells from being harmed by risk factors such as high blood sugar,but the activation of unfolded protein response can enhance the progress of diabetic nephropathy,while excessive and prolonged ERS triggers cell apoptosis through disturbing the functions of the endoplasmic reticulum.These unfolded proteins aggregated in the endoplasmic reticulum can disturb the function of endoplasmic reticulum and trigger some related cellular signal pathways in down stream,and finally results in apoptosis which promotes the progress of diabetic kidney disease.Therefore,the role of ERS in both diabetes and its complications should be further explored.

Key words:Diabetic nephropathy； Endoplasmic reticulum stress； Diabetes

收稿日期：2014-05-26修回日期：2014-11-20编辑：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.10.039

中图分类号:R587.1

文献标识码:A

文章编号：1006-2084(2015)10-1834-03