化浊抑溃安肠汤对溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

李瑞东，李瑞玉，高静炎

(邢台医学高等专科学校第二附属医院，河北 邢台 054000)

论 著

化浊抑溃安肠汤对溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

李瑞东，李瑞玉，高静炎

(邢台医学高等专科学校第二附属医院，河北 邢台 054000)

目的探讨化浊抑溃安肠汤治疗溃疡性结肠炎的作用机制。方法将60只SD大鼠随机分为正常组、模型组、柳氮磺吡啶组、化浊抑溃安肠汤组,每组15只。除正常组外,其余各组均采用5%2,4,6三硝基苯磺酸灌肠复制溃疡性结肠炎大鼠模型,造模后，模型组、柳氮磺吡啶组、化浊抑溃安肠汤组分别给予生理盐水、柳氮磺吡啶混悬液、化浊抑溃安肠汤灌胃，1次/d，连续4周。4周后处死大鼠，镜下观察大鼠结肠黏膜固有层淋巴细胞凋亡情况，用免疫组织化学染色及TUNEL染色观察大鼠结肠黏膜固有层淋巴细胞Bcl-2及Bax蛋白的表达情况。结果模型组Bcl-2蛋白表达量明显高于正常组，Bax蛋白表达量明显低于正常组；柳氮磺吡啶组、化浊抑溃安肠汤组Bcl-2蛋白表达量明显低于模型组，Bax蛋白表达量明显高于模型组，且化浊抑溃安肠汤组Bcl-2蛋白表达量明显低于柳氮磺吡啶组，Bax蛋白表达量明显高于柳氮磺吡啶组。结论化浊抑溃安肠汤对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜细胞凋亡有一定的调节作用，可上调大鼠Bcl-2水平，下调Bax水平。

化浊抑溃安肠汤；Bcl-2蛋白；Bax蛋白；大鼠；溃疡性结肠炎

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种原因尚不明确的结肠黏膜慢性炎症和溃疡病变，主要累及直肠和乙状结肠，严重时可累及全结肠，其病理表现主要为黏膜和黏膜下层的慢性炎性细胞浸润、隐窝脓肿、黏膜溃疡以及腺体和上皮的损伤。西医采用免疫抑制剂、水杨酸制剂、糖皮质激素治疗短期效果较好，但易复发，迁延难愈[1]。目前研究表明，结肠黏膜淋巴细胞增殖与凋亡以及它们之间的相对平衡关系影响着溃疡性结肠炎的修复过程[2]，细胞是否凋亡决定着溃疡的愈合情况[3]。Bcl-2和Bax蛋白主要分布于细胞膜、内质网及线粒体上[4]，在决定细胞增殖与凋亡过程中起决定作用，其中Bcl-2蛋白拮抗细胞凋亡，而Bax蛋白促进细胞凋亡，两者比值决定细胞增殖还是凋亡。化浊抑溃安肠汤是从"浊毒"的致病理论出发研制而成的具有解毒化浊、健脾祛湿安肠作用的中药复方，用于治疗溃疡性结肠炎疗效显著，复发率低，但其具体作用机制尚不明确。本研究选择三硝基苯磺酸免疫造模法复制溃疡性结肠炎大鼠模型(该模型的制备与人类结肠溃疡在组织形态上颇为相似，是目前普遍认可的使用方法)，观察了化浊抑溃安肠汤对模型大鼠Bax 和Bcl-2蛋白表达的影响，旨在探讨该复方治疗溃疡性结肠炎的作用机制。

1 实验资料

1.1实验动物 清洁级健康SD大鼠60只，雌雄各半，体质量(240±20)g，河北医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：DK1209041，适应性喂养1周。

1.2试剂 5% 2,4,6,三硝基苯磺酸(TNBS)购自上海信裕生物科技有限公司；无水乙醇和戊巴比妥钠购自上海伊卡生物技术有限公司，批号：20120287。TUNEL染色试剂盒由北京博尔迈生物技术有限公司提供；大鼠Bcl-2及Bax免疫组化试剂盒购自上海信裕生物科技有限公司。

1.3药物 化浊抑溃安肠汤由我院中药房提供，药物组成：白头翁60 g、黄连15 g、人参10 g、黄芪30 g、秦皮12 g、苦参12 g、地榆15 g、广木香12 g、薏苡仁30 g、当归15 g、白芍15 g、茯苓15 g、白术12 g、甘草9 g。按处方称取药材，加入清水煎煮，水浴浓缩到所需浓度备用。柳氮磺吡啶肠溶片(SASP)，0.5 g/片，上海福达制药有限公司生产，批号：044131005。

1.4方法

1.4.1造模、分组及给药 健康清洁级SD大鼠60只，适应性饲养1周后，随机分为正常组、模型组、柳氮磺吡啶组、化浊抑溃安肠汤组，每组15只。正常组不造模、不灌胃，正常喂养；其余各组大鼠禁食24 h后称体质量，使用1%戊巴比妥钠30 mg/kg进行腹腔注射麻醉，以直径为2 mm的橡胶管插入大鼠结肠8 cm处，向结肠腔内灌注TNBS液60 mg/kg[5]，将大鼠倒立30 s，使药液到达全结肠，然后放回笼待其自然苏醒。模型组于造模后第2天给予10 mL/kg生理盐水灌胃，每日1次，连续4周；柳氮磺胺吡啶组于造模后第2天给予柳氮磺吡啶灌胃，先将药片研成粉状，过筛后用蒸馏水配成混悬液，按0.267 g/kg(相当于成人用药量的8倍)给药，每日1次，连续4周；化浊抑溃安肠汤组于造模后第2天给予化浊抑溃安肠汤灌胃，将中药水煎后浓缩成4.59 g/kg灌胃，每日1次，连续4周。

1.4.2TUNEL染色检测细胞凋亡情况 以上4组除正常组外，分别选取溃疡病变最明显的肠段，各取3块组织进行活检，所取标本在10%福尔马林溶液中浸泡5 min固定，HE染色。所有标本在放大400倍的镜下观察，每张切片随机观察5个视野，每个视野计数200个结肠黏膜上皮细胞中的阳性细胞数，计数中凋亡细胞比率的均数为凋亡指数。在同一条件的光学显微镜下观察发现，正常细胞核呈蓝色；凋亡细胞核中有棕黄色或棕褐色颗粒表达，细胞核染色深浅不一。

1.4.3结肠组织中Bax和Bcl-2表达检测 采用免疫组织化学S-P法检测。将石蜡切片切成5 μm厚，先用二甲苯脱蜡处理，再用梯度乙醇水化；枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)在高温、高压下使抗原修复2 min，每张切片均加用动物免疫血清室温下孵育10 min，去掉血清，加用Bcl-2和Bax抗体，4 ℃备用， PBS液洗5 min×3次，再加用生物标记第二抗体，室温下孵育10 min，PBS液洗5 min×3次，苏木素复染，用已知阳性标本作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。每张切片随机选取5个高倍视野,计数200个细胞,计算阳性细胞的百分比，并在放大100倍镜下计数阳性细胞数。在光镜下胞质呈棕黄色或褐色颗粒为阳性表达。

2 结 果

2.1TUNEL染色细胞凋亡情况 病理切片HE染色，正常组镜下肠黏膜上皮完整，各层结构清晰，腺体结构排列规则，黏膜下血管丰富，无充血水肿，无溃疡糜烂，杯状细胞丰富，固有层可见毛细血管和散在的淋巴细胞，见图1；模型组镜下黏膜层完全脱失，黏膜下有大量炎细胞浸润，杯状细胞明显减少，可见因坏死而无结构的嗜伊红组织，溃疡及不同程度的灶性糜烂形成，少量炎性肉芽组织增生，肠腔可见渗出液及坏死组织，黏膜肌消失，见图2；柳氮磺胺吡啶组黏膜下间质水肿，较多致密的胶原纤维与溃疡面平行排列，固有层及黏膜下层炎细胞浸润，溃疡周边肠黏膜腺体杯状细胞减少，部分黏膜仍可见到渗出、坏死，见图3；化浊抑溃安肠汤组腺体排列较规整，可见大量的杯状细胞，黏膜下间质轻度水肿，间质少量炎细胞浸润，见图4。

图1 正常组 HE染色表现(×400)

图2 模型组HE染色表现(×400)

图3 柳氮磺胺吡啶组HE染色表现(×400)

图4 化浊抑溃安肠汤组HE染色表现(×400)

2.2大鼠结肠黏膜组织中Bcl-2和Bax蛋白表达情况 正常大鼠结肠上皮细胞可见到少量Bcl-2表达，主要表达于结肠隐窝基底部，见图5；模型组大鼠结肠上皮细胞可见到大量Bcl-2表达，为固有层炎性细胞，见图6；经柳氮磺胺吡啶及化浊抑溃安肠汤治疗后，Bcl-2表达出现不同程度减弱，见图7及图8。Bax在正常大鼠结肠上皮细胞表达较强，见图9；模型组病变部位表达较弱，见图10；经柳氮磺胺吡啶及化浊抑溃安肠汤治疗后， Bax不同程度增强，见图11及图12。各组大鼠结肠黏膜细胞组织中Bcl-2 、Bax表达量见表1。模型组大鼠结肠黏膜中，上皮细胞、浆细胞、淋巴细胞和中性粒细胞均有Bcl-2阳性表达，其中淋巴细胞表达率最高，上皮细胞表达率最低，与正常组比较差异有统计学意义(P均<0.05)，见表2；Bax在浆细胞、中性粒细胞和淋巴细胞中的表达率明显低于正常组(P均<0.05)，在上皮细胞中的表达率2组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

3 讨 论

溃疡性结肠炎属中医“休息痢”“泻下”等范畴，导师李佃贵教授在长期临床实践基础上总结认为该病可从“浊毒”致病角度论治，所拟化浊抑溃安肠汤用于治疗该病效果较好。方中重用白头翁为君药，该药入大肠经，能清热燥湿、止血止痢，黄连清热燥湿，与白头翁一起祛除大肠湿热[6]，切中溃疡性结肠炎湿热壅滞大肠、留恋不去之病机。以人参、黄芪、茯苓、白术为臣，鼓舞正气，健脾益气，以助生化之源：黄芪温养脾胃而生肌，补益气血而托毒，与人参配伍，能使气血不足、久溃不敛者生肌收口，此组药物针对溃疡性结肠炎正虚之本证所设。佐以薏米、苦参、秦皮健脾燥湿，解毒止痢；木香、地榆、当归活血化瘀、补血止血、行气止痛，专为调理患者久病入血、气滞血凝、气虚血少、血不归经症状所设。白芍和甘草调和诸药，缓急止痛。诸药合用，调和气血肠胃、清利湿热，既解毒化浊、清热利湿，又健脾温肾，更兼涩肠止泻、活血化瘀。如此运用则能使正虚补，邪实祛，很大程度上缓解了溃疡性结肠炎的发作[6]。现代药理研究证实，方中黄连含小檗碱(黄连素)、甲级黄连碱等多种生物碱，对多种革兰阳性和阴性菌有抑制作用，对痢疾杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌等有较显著抑制作用，以黄连粉法直接喷到溃疡部位或定位灌肠治疗溃疡性结肠炎均取得较好疗效[7]；木香含有挥发油和总生物碱，对胃肠道有兴奋和抑制的双向作用[7]；人参、黄芪、当归、黄连能够调节机体免疫功能，人参皂甙和人参多糖是人参调节免疫功能的活性成分；黄芪、当归、黄连、地榆还有不同程度的抗炎抑菌作用。

图5 正常组 Bcl-2表达情况(×200)

图6 模型组Bcl-2表达情况(×200)

图7 柳氮磺胺吡啶组Bcl-2表达情况(×200)

图8 化浊抑溃安肠汤组Bcl-2表达情况(×200)

图9 正常组Bax表达情况(×200)

图10 模型组Bax表达情况(×200)

图11 柳氮磺胺吡啶组Bax表达情况(×200)

图12 化浊抑溃安肠汤组Bax表达情况(×200)

表1 各组大鼠结肠黏膜细胞组织中Bcl-2、Bax表达情况

注:①与正常组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

表2 模型组和正常组结肠黏膜组织中Bcl-2在各细胞中的阳性表达情况 只(%)

注：①与正常组比较，P<0.05。

表3 模型组和正常组结肠黏膜组织中Bax在各细胞中的阳性表达情况 只(%)

注：①与正常组比较，P<0.05。

近年研究发现溃疡性结肠炎上皮细胞损伤和黏膜溃疡与细胞凋亡有关[8],细胞凋亡是由基因控制的细胞自主性死亡方式，是机体自身稳定的重要凋节机制。溃疡性结肠炎发病过程中Bcl-2/Bax基因蛋白的调控起主要作用；在细胞凋亡的基本调控网络中，Bcl-2基因家族起关键作用[9]。Bcl-2抑制caspase激活的细胞凋亡，延长细胞存活时间，增加细胞对抗多种凋亡的刺激因素。相反，凋亡前分子Bax则通过作用于线粒体，调节caspase活性，以二聚体或多聚体形式与Bcl-2结合，拮抗Bcl-2的作用，可提高细胞凋亡的敏感性，直接促进细胞凋亡。 Bcl-2与Bax蛋白表达比例对控制细胞凋亡的强弱起到关键作用。Bax增强，促进细胞凋亡；Bcl-2增强，抑制细胞凋亡。这说明Bcl-2和Bax基因的重新调整对肠黏膜上皮细胞凋亡、溃疡愈合起着非常重要的作用。

本研究结果发现，Bcl-2广泛表达于活动期溃疡性结肠炎大鼠的结肠黏膜上皮细胞和固有层炎性细胞，其中淋巴细胞中阳性表达率最高；而大鼠结肠黏膜炎性细胞中Bax的表达较正常组明显降低，说明溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜凋亡调控蛋白Bcl-2表达增加以炎性细胞为主，上皮细胞表达较弱，而炎性细胞中Bax表达减少，提示溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜炎性细胞凋亡的减慢和上皮细胞凋亡增加同步发生，上皮细胞和炎性细胞凋亡的不协调导致结肠黏膜的炎性反应与上皮的缺失脱落及溃疡形成，Bcl-2和Bax蛋白表达异常并诱导结肠黏膜细胞凋亡是溃疡性结肠炎结肠黏膜损伤的分子机制之一。而化浊抑溃安肠汤能上调Bcl-2的表达，下调Bax的表达，为溃疡性结肠炎的中医中药治疗提供了新的理论基础。但溃疡性结肠炎结肠黏膜损伤的发病机制复杂，尚需大量的实验进一步深入研究。

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Effect of Huazhuo Yikui Anchang decoction on the expression of Bcl-2, Bax gene protein in intestinal mucosa of ulcerative colitis rats

LI Ruidong, LI Ruiyu, GAO Jingyan

(The Second Affiliated Hospital of Xingtai Medical College, Xingtai 054000, Hebei, China)

Objective It is to explore the mechanism of action of Huazhuo Yikui Anchang decoction (HZYKAC decoction) on ulcerative colitis. Methods 60 SD rats were randomly divided into normal group, model group, willow nitrogen sulfonyl pyridine group, HZYKAC decoction group, each group had 15 rats. All the rats except in normal group were selected to establish ulcerative colitis rats models with 5% 2, 4, 6 trinitrobenzene sulfonic acid by clysis, after establishing model group, willow nitrogen sulfonyl pyridine group, HZYKAC decoction group were respectively given normal saline, willow nitrogen sulfonyl pyridine suspension liquid, HZYKAC decoction by intragastric infusion once per day, and they were treated for 4 weeks. After 4 weeks the rats were killed to observe ulcerative colitis rats colon mucosa laminapropria lymphocyte apoptosis under electron microscope, immunohistochemical staining and TUNEL staining was used to observe the expression of Bcl-2 and Bax protein in colon mucosa lamina propria lymphocyte. Results The expression of Bcl-2 was higher while that of Bax was lower in modal group than that in normal group; the expression of Bcl-2 was lower and that of Bax was higher in willow nitrogen sulfonyl pyridine group, HZYKAC decoction group than that in model group; the expression of Bcl-2 was lower and that of Bax was higher in HZYKAC decoction group than that in willow nitrogen sulfonyl pyridine group. Conclusion HZYKAC decoction has a regulating effect on colon mucosa apoptosis in ulcerative colitis rats, which can up-regulating Bcl-2 and down-regulating Bax.

Huazhuo Yikui Anchang decoction; Bcl-2; Bax; rat; ulcerative colitis

李瑞东，女，硕士，副主任医师，副教授，主要从事中西医结合治疗消化系统疾病的研究。

李瑞玉，E-mail:liruiyu651021@163.com

河北省科技厅计划项目(122777105)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.31.001

R-332

A

1008-8849(2015)31-3421-05

2015-06-01