ALDH1作为肺癌干细胞功能标志物的研究

卓 越，梁 冬

(海南省农垦三亚医院，海南 三亚 572000)

ALDH1作为肺癌干细胞功能标志物的研究

卓 越，梁 冬

(海南省农垦三亚医院，海南 三亚 572000)

目的探讨乙醛脱氢酶-1(ALDH1)作为肺癌干细胞标志物在肺癌中的表达情况及临床意义。方法采用免疫组化法检测44例肺癌组织及癌旁组织中ALDH1的表达情况，分析ALDH1表达情况与临床病理特征、无病生存率的相关性，应用COX比例风险模型分析预后影响因素。结果肺癌组织中ALDH1阳性表达率明显高于癌旁组织(P<0.05)。ALDH1表达情况与肺癌患者的年龄、性别、肿块大小、吸烟指数、组织学类型和淋巴结转移无明显相关性(P均>0.05)，与TNM分期与分化程度明显相关(P均<0.05)。ALDH1阳性表达患者无病生存率明显低于阴性表达者(P<0.05)。多因素COX比例风险模型分析显示ALDH1表达与TNM分期是影响患者预后的独立危险因素(P均<0.05)。结论ALDH1在肺癌组织中呈现高表达，表达差异与TNM分期及分化程度相关；ALDH1阳性表达患者预后较差，与TNM分期同为患者预后的独立危险因素。检测ALDH1的表达情况对判断患者的预后有重要意义。

ALDH1；肺癌；肺癌干细胞；TNM分期；分化程度

肺癌干细胞起源于肿瘤干细胞学说(CSC)，是指存在于肺癌肿瘤组织中的部分未分化并具有自我更新和增殖分化能力、数目较少但具有较强致瘤性的肿瘤细胞群[1]。流式分流细胞术(FACS)的广泛应用使人们对肿瘤干细胞的生物学特性有了更深的了解，使肺癌干细胞的靶向治疗成为了肺癌治疗的研究热点。对肿瘤干细胞的研究发现，肺癌干细胞标记物为肿瘤干细胞的分选鉴别提供了较有效的参考标准和依据。目前已知的肺癌干细胞表面标记物主要有CD133、CD147、CD117、CD34、CD44、ABCG2OCT4和乙醛脱氢酶-1(ALDH1)，其中CD133、CD147、CD117、CD34和ALDH1属于阳性标志物，CD24、CD45属于阴性标志物。多数研究表明，这些标志物对筛选肺癌干细胞的准确性及特异性有一定的作用[2-5]，但目前并未有明确研究证明这些标志物对所有亚型的肺癌干细胞适用，因此多为联合检验。目前关于ALDH1在肺癌干细胞中表达的研究已经在国外取得了初步的进展[6-7]，但国内关于此研究的报道较少。本研究在国外研究的基础上，探讨了ALDH1作为肺癌干细胞标志物在肺癌中的表达情况及临床意义，现将结果报道如下。

1 临床资料

1.1一般资料 收集2011年1月—2013年12月在我院住院手术切除肺癌的组织标本44例，术前未经过化疗及放疗，经病理学确诊，临床资料完整；排除合并心、肝、肾和造血系统疾病者，精神疾病者。其中男23例，女21例；年龄30～75(46.64±9.45)岁；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期29例，Ⅲ～Ⅳ期15例；腺癌23例，鳞癌14例，小细胞癌7例；未分化癌4例，低分化癌15例，中分化癌16例，高分化癌9例；出现淋巴结转移21例。同时取患者配对癌旁组织(距癌病灶距离≥5cm)。本研究获得医院伦理委员会批准。

1.2试剂和仪器 兔抗人ALDH1单克隆抗体(上海信裕生物科技)，工作液浓度为1:100；DAB酶底物显色试剂盒(福州迈新生物技术)；柠檬酸修复液(长沙明瑞化工)；二甲苯(长沙唐华化工贸易)；盐酸乙醇(1%，长沙震天化工)；PBS缓冲液(北京奥博来科技)；过氧化氢(苏州荣芳化工)；苏木精染液(上海博谷生物)。

1.3检测方法 标本经甲醛固定、梯度乙醇脱水和石蜡包埋后切片，厚度为4um。将标本经烤箱干燥后二甲苯脱蜡、脱二甲苯，梯度乙醇水化后，枸橼酸缓冲液进行抗原修复，蒸馏水煮沸后冷却；PBS缓冲液洗涤2 min×3次，3%H2O2溶液清洗后室温放置30 min以消除内源性过氧化酶；PBS缓冲液洗涤2 min×3次，滴加一抗置于冰箱后再次PBS缓冲液洗涤2 min×3次，滴加二抗室温孵育30 min，PBS缓冲液洗涤2 min×3次后加入DAB显色、苏木精染色、梯度乙醇脱水、中性树胶封片。以PBS代替一抗作阴性对照，已知阳性切片作阳性对照。

1.4结果判定 由2名病理科医师对结果进行判定，参考文献[8-9]标准评定。染色强度：无着色为0分，淡黄色为1分，黄色或深黄色为2分，(棕)褐色为3分；阳性细胞比例：0为阴性，<25%为1分，26%～50%为2分， 51%～75%为3分，>75%为4分。染色强度评分与阳性细胞数比例相乘即为最后评分：0分为阴性，>1分为阳性。

1.5统计学方法 采用SPSS 17.00软件对数据进行统计学分析。计数资料用2、Fisher精确概率法比较，患者生存分析采用Kaplan-Meier生存曲线表示，影响因素分析采用COX比例风险模型分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1ALDH1在不同组织中表达情况 肺癌组织中ALDH1阳性表达率为48%(21/44)，癌旁组织中ALDH1阳性表达率为18%(8/44)，二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。ALDH1主要表达于癌细胞浆中，在肺癌细胞中多数呈片灶状表达，在间质细胞中可见少量表达，癌旁组织中表达较少。见图1及图2。

2.2ALDH1表达与肺癌患者临床病理特征关系 44例肺癌患者中，ALDH1表达差异同患者的年龄、性别、肿块大小、吸烟指数、组织学类型和淋巴结转移无统计学意义(P均>0.05)；TNM Ⅰ～Ⅱ期与Ⅲ～Ⅳ期中ALDH1阳性表达率差异有统计学意义(P<0.05)；无和低度分化的ALDH1阳性表达共14例占74%，中高度分化的阳性表达为10例占40%，2者比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

图1 ALDH1在肺癌组织的阳性表达情况(Elivvision法×400)

图2 ALDH1在癌旁组织的阳性表达情况(Elivvision法×400)

表1 ALDH1表达与临床病理特征的关系 例(%)

2.3ALDH1表达与肺癌患者无病生存期(DFS)关系 44例肺癌患者均接受随访，随访时间6～36个月，中位随访时间23个月。ALDH1阳性表达者DFS为(21.95±7.61)个月，阴性表达者DFS为(30.70±6.29)个月，二者比较差异有统计学意义(t=4.169,P<0.05)。见图3。

图3 ALDH1表达差异与肺癌患者DFS情况

2.4多因素COX比例风险模型分析 将年龄、性别、肿块大小、吸烟指数、TNM分期、组织学类型、分化程度和淋巴结转移及ALDH1表达纳入COX比例风险模型进行分析，结果显示ALDH1表达和TNM分期是影响肺癌患者DFS的独立风险因素。见表2。

表2 多因素COX比例风险模型分析结果

3 讨 论

肺癌在我国发病率较高，严重威胁着人类的身心健康，但尚并无明确有效的治疗方法。研究显示，在经过系统的放射治疗或靶向治疗后，患者无病生存期为6.2个月，总生存期为12.3个月[10]，治疗效果较差。目前肿瘤治疗研究热点——肿瘤干细胞学说对肿瘤的预防、诊治取得了一定的进展。ALDH1作为在细胞质并赋予肺癌干细胞耐药性的肿瘤干细胞阳性表达标记物，在肺癌特别是非小细胞肺癌中的表达在国外已有研究[11-12]。ALDH1是一组将乙醇氧化为乙酸的同工酶，以保护细胞免受过氧化物的危害。ALDH1定位于细胞质中，参与调控多种组织分化，其在造血干细胞、神经干细胞及乳腺干细胞中呈现高表达。而ALDH1作为肺癌干细胞经典标志物，与肺癌患者的预后情况研究较少。

本研究利用免疫组化法检测ALDH1表达情况，结果显示ALDH1在肺癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁组织，且ALDH1阳性表达与肺癌患者的TNM分期和分化程度密切相关，与Jiang等[7]研究结果相似。另外ALHD1阳性表达者预后较阴性表达者差，多因素COX比例风险模型分析发现，ALDH1与TNM分期是肺癌患者预后的独立危险因素。提示干细胞越丰富，相对恶性程度就越高，术后预后较差。

综上所述， ALDH1在肺癌组织中呈现高表达，表达差异与TNM分期及分化程度相关；ALDH1阳性表达患者预后较差，与TNM分期同为患者预后的独立危险因素。检测ALDH1的表达情况对判断患者的预后有重要意义。

[1] Magee JA,Piskounova E,Morrison SJ. Cancer stem cells:impact,heterogeneity,and uncertainty[J]. Cancer Cell,2012,21(3):283-296

[2] Lennartsson J,Rönnstrand L. Stem cell factor receptor/c-Kit:from basic science to clinical implications[J]. Physiol Rev，2012，92(4):1619-1649

[3] Ma I,Allan AL. The role of human aldehyde dehydrogenase in normal and cancer stem cells[J]. Stem Cell Rev,2011,7(2):292-306

[4] Sterneckert J,Höing S,Schöler HR. Concise review:Oct4 andmore:the reprogramming expressway[J]. Stem Cells,2012,30(1):15-21

[5] Buck K,Hug S,Seibold P,et al. CD24 polymorphisms in breast cancer:impact on prognosis and risk[J]. Breast Cancer Res Treat,2013,137(3):927-937

[6] Ucar D,Cogle CR,Zucali JR,et al. Aldehyde dehydrogenase activity as a functional marker for lung cancer[J]. Chem Biol Interact,2009,178(1/3):48-55

[7] Jiang F,Qiu Q,Khanna A,et al. Aldehyde dehydrogenase 1 is a tumor stem cell-associated marker in lung cancer[J]. Mol Cancer Res,2009,7(3):330-338

[8] Ginestier C,Hur MH,Charafe-Jauffret E,et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome[J]. Cell Stem Cell,2007,1(5):555-567

[9] Patel M,Lu L,Zander DS,et al. ALDH1A1 and ALDH3A1 expression in lung cancers: correlation with histologic type and potential precursors[J]. Lung Cancer,2008,59(3):340-349

[10] Sadowska AM,Nowé V,Janssens A,et al. Customizing systemic therapy in patients with advanced non-small cell lung cancer[J]. Ther Adv Med Oncol,2011,3(4):207-218

[11] Nguyen GH,Murph MM,Chang JY. Cancer stem cell radioresistance and enrichment:where frontline radiation therapy may fail in lung and esophageal cancers[J]. Cancers (Basel),2011,3(1):1232-1252

[12] Sullivan JP,Spinola M,Dodge M,et al. Aldehyde dehydrogenase activity selects for lung adenocarcinoma stem cells dependent on notch signaling[J]. Cancer Res,2010,70(23):9937-9948

Study on ALDH1 as the functional marker of lung cancer stem cells

ZHUO Yue, LIANG Dong

(Hainan Province Nongken Sanya Hospital, Sanya 572000, Hainan, China)

Objective It is to investigate the expression and clinical significance of ALDH1 as a marker of lung cancer stem cells in lung cancer. Methods The expressions of ALDH1 in tissue adjacent to carcinoma, and lymph node metastasis in 44 cases of patients with lung cancer were detected by immunohistochemical method. The relevance of ALDH1 expressions of patients with lung cancer with clinicopathologic features and Disease-free survivals (DFS) were analyzed, and the prognostic influence factors were analyzed by COX proportional hazard model.Results The positive expression rate of ALDH1 in cancer tissues was markedly higher than that of tissue adjacent to carcinoma (P<0.05). There was no significant correlation between the ALDH1 expression with age, gender, tumor size, smoking index, histological type and lymph node metastasis (allP>0.05), but was significant correlation between the ADHL1 expression with TNM staging and its differentiation (allP<0.05). The DFS of patients with positive expression of ALDH1 were markedly shorter than that of ones with negative expression (P<0.05). The results of analysis of multivariable COX model showed that the ALDH1 expression and TNM staging were the independent factors influencing the prognosis of patients (allP<0.05). Conclusion ALDH1 shows a high expression in lung cancer tissues, and expression differences are associated with TNM stage and differentiation. ALDH1 patients with positive expression have poorer prognosis, and ALDH1 expression and TNM staging are independent factors affecting prognosis of patients. So it is important and significant to observe ALDH1 expression in clinic.

ALDH1; lung cancer; lung cancer stem cells; TNM stage; differentiation degree

卓越，男，主治医师，研究方向为呼吸科与肿瘤内科疾病。

梁冬，E-mail:Liangdong223@163.com

海南省卫生厅资助项目(2012PT-36)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.33.002

R734.2

A

1008-8849(2015)33-3652-03

2015-06-01