肺癌组织中Toll样受体9的表达及其对术后放疗生存的影响

高彩霞，乔田奎*，张 彬，袁素娟

（复旦大学附属金山医院肿瘤科，上海201508）

Toll样受体(Toll-like receptor，TLRs)是存在于哺乳动物且与Toll蛋白同源的分子，参与非特异性免疫。目前研究发现TLR9在多种肿瘤细胞中有表达，而且认为TLR9的表达参与了肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移，影响着肿瘤的临床分期；也有报道肿瘤细胞TLR9高表达与放化疗抗拒有关，从而影响着肿瘤的放化疗结果。本文通过对63例在我院进行手术治疗的肺癌患者肿瘤组织TLR9阳性表达进行检测，旨在分析TLR9在肺癌组织中的表达特点及其对肺癌患者术后放疗生存的影响。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集2007年3月至2011年12月期间在本院进行手术切除的肺癌患者术后组织标本66例，病理蜡块保存完好，术前均未接受放化疗；其中鳞癌33例(角化型鳞癌和非角化性鳞癌各1例)，腺癌27例(乳头状腺癌1例、肺泡癌2例)，腺鳞癌3例，肉瘤样癌3例，小细胞肺癌2例，黏液腺癌1例(肠癌肺转移)；局部淋巴结转移29例，无淋巴结转移37例，同侧肺内发生转移2例，发生胸壁肿瘤侵犯2例；剔除小细胞肺癌和肺转移癌病例，最终选择63例肺癌术后组织蜡块作为本实验的有效组织标本来源。

1.2 患者一般情况及随访资料

63例患者均在本院接受肺癌诊断和治疗，其中男性52例，女性11例，年龄最小36岁，最大76岁，中位年龄63岁，有吸烟史42例，无吸烟史者21例；2例患者接受单侧全肺切除术加局部淋巴结清扫，其余61例患者均为肺叶切除术加同侧肺门及纵膈淋巴结清扫。按照国际抗癌联盟(Union for International Cancer Control，UICC)1997年TNM分期标准，Ⅰ期12例、Ⅱ期35例、Ⅲ期12例、Ⅳ期4例(Ⅳ期患者中包括2例胸膜转移，1例胸壁局部侵犯和1例心包癌结节)；纵隔淋巴结转移28例，35例无纵隔淋巴结转移；术后未行放疗者27例，术后放疗者36例，25例患者接受了术后化疗。术后化疗始于手术后1月左右，签订化疗知情同意书，化疗以含铂方案为主，NP(第1天和第8天盖诺30 mg/m2，第1～3天顺铂30 mg/m2)方案13例；TP(第1天多西紫杉醇100 mg/m2或紫杉醇135～175 mg/m2，第1～3天顺铂30 mg/m2)方案10例，GP(第1天和第8天吉西他滨1000 mg/m2，第1～3天顺铂30 mg/m2)方案2例，以术后化疗4个周期为准，7例患者完成4个周期化疗，13例患者完成2个周期化疗，5例患者因反应大未完成1个周期化疗，25例患者平均术后化疗2.5个周期。化疗期间常规止吐镇静抗过敏治疗，配合顺铂化疗加大补液量并给予呋塞米治疗；化疗后1周复查血常规，白细胞降低者给与升白治疗。

本组患者治疗结束后3个月开始进行随访，随访截止至2012年2月，术后2年每3个月随访1次，之后半年随访1次，随访时间最短为12个月，最长为56个月，中位随访时间38个月，期间记录患者无进展生存期(progression-free survival，PFS)和总生存期(overall survival，OS)；截止随访结束死亡58例，均死于肿瘤局部复发或远处转移，4例仍然健在，1例失访，随访率为98.4%，随访形式以预约门诊为主，信函或电话随访作为补充。

1.3 术后放疗

依据美国国立综合癌症网络(National C omprehensive Cancer Network，NCCN)肺癌治疗指南进行肺癌术后放疗，针对切缘阳性患者和Ⅱb以上患者行术后放疗，放疗前进行卡氏评分和肺功能测定，静脉血化验血常规和肝肾功能，签订放疗知情同意书。共36例患者接受术后放疗，肺癌术后1～3个月开始术后放疗，或化疗后进行术后放疗。常规三维适形放疗体膜制作-定位-计划，CT扫描层厚4 mm，定位扫描图像直接传输至治疗计划系统(treatment planning system，TPS)，常规勾画体表、肺脏、心脏及脊髓，肿瘤临床靶区(clinical target volume，CTV)包括气管支气管断端、同侧肺门淋巴结区、隆突下淋巴结区，右侧肺癌患者术后靶区CTV包括血管前气管后淋巴结区，左肺癌患者术后靶区CTV包括主动脉弓上淋巴结区和主动脉窗淋巴结区，CTV外放5 mm为计划靶区(planning target volume，PTV)；计划要求95%等剂量线覆盖PTV，6 MV X射线三维适形放疗，三野或四野等中心照射，常规分割，处方剂量2 Gy/次，双肺平均剂量≤18 Gy，双肺V20(接受20 Gy照射的肺体积与肺总体积之比)≤30%，心脏剂量限制45 Gy，脊髓剂量限制45 Gy。对于手术切缘阳性患者，治疗50 Gy后缩野至支气管断端加量至56～60 Gy。36例患者均按计划完成术后放疗，未发生严重的放疗合并症。

1.4 实验方法

1.4.1 免疫组化SP法肿瘤组织蜡块4 μm切片固定，经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化，将切片置于0.01 mol/L(pH 6.0)柠檬酸盐缓冲液中进行微波抗原热修复，中高火修复40 min，室温冷却30 min，PBS冲洗；3% H2O2室温处理10 min，山羊血清室温孵育10 min，滴加稀释的一抗(鼠抗人TLR9单克隆抗体购自美国Abcam公司，TLR9稀释比1∶100)，4 ℃过夜；滴加生物素标记的二抗(购自福州迈新生物技术有限公司)，37 ℃孵育20 min，DAB显色(DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司)；经苏木精对比染色后脱水、透明、封片。用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4.2 结果判断TLR9蛋白阳性信号定位于细胞浆内呈棕黄色颗粒样物质。高倍镜下随机选取5个视野(×400)，每个视野计数100个细胞，按染色细胞数和染色程度综合判断，最终结果采用双评分法：①按阳性细胞百分率评分。＜25%为0分，≥25%～50%为1分，≥50%～75%为2分，≥75%为3分；②按染色强度评分。无显色为0分，浅棕黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将上述两项得分相加，0～1分为-，2～3分为+，4～5分为++，6分为+++，其中++～+++视为TLR9阳性表达，-～+视为TLR9阴性表达。

1.5 统计学分析

应用SPSS 17.0软件，TLR9与各临床病理特征之间的关系采用χ2检验；应用Kaplan-Meier法进行术后放疗单因素生存分析，采用对数Log-Rank检验和Cox比例风险模型进行术后放疗生存多因素分析。

2 结果

2.1 TLR9表达情况

免疫组化结果显示，TLR9蛋白定位于肺癌组织的肿瘤细胞质中，呈均匀的棕黄色颗粒样物质，而正常肺泡细胞内未见TLR9蛋白阳性表达(见图1)；63例肺癌患者中TLR9阳性表达43例阳性表达率为68.3%；其中TLR9强阳性(+++)表达5例，TLR9未见表达5例。

2.2 TLR9阳性表达率与肺癌的临床病理特征分析

根据不同临床病理特征的TLR9表达情况进行单因素分析，见表1。结果显示：TLR9表达阳性率在肺癌不同性别、年龄、吸烟史、病变部位、有无术后放化疗、病理类型、TNM分期以及不同的肿瘤分化程度中差异均无统计学意义(P均＞0.05)；原发肿瘤直径和淋巴结转移情况不同的患者中，TLR9阳性表达率差异具有统计学意义(P均＜0.05)，提示TLR9表达与肺癌的肿瘤直径及淋巴结转移有相关性。

2.3 TLR9表达对肺癌患者术后生存的影响

截止随访结束，58例患者死亡，5例仍存活，OS中位值为34.0个月，PFS中位值为23.4个月，63例肺癌患者中，TLR9阴性和阳性表达的患者中位PFS依次为32.0±2.7和21.0±0.9，中位OS依次为47.0±8.0和31.0±1.1，TLR9阴性表达较TLR9阳性表达患者的PFS明显延长，TLR9阴性表达患者具有一个较长的OS。

进一步对36例术后放疗患者以不同TLR9表达水平(阴性或阳性)、淋巴结转移状况、病理类型(鳞癌或腺癌)以及肿瘤直径进行Kaplan-Meier单因素生存分析，采用对数Log-Rank检验，结果显示(见表2)：肺癌病理类型与术后放疗患者的PFS有相关性(χ2=6.67，P=0.01)，而对术后放疗患者的OS生存影响无统计学意义(P=0.07)；淋巴结是否发生转移对术后放疗患者生存的OS影响有统计学意义(χ2=7.01，P=0.01)，对PFS的影响无统计学意义(P=0.06)；肿瘤直径对术后放疗患者生存的PFS和OS均显示出有统计学意义(P=0.00)，肿瘤组织的TLR9表达状态对PFS和OS均有影响(P均=0.00)，TLR9阴性表达的肺癌术后放疗患者具有较为明显的PFS和OS优势。

表1 肺癌的临床病理特征与TLR9表达

表2 36例肺癌患者术后放疗生存Kaplan-Meier单因素分析结果

2.4 肺癌术后放疗生存因素的Cox回归分析

将肺癌术后放疗生存的各因素作为自变量统一纳入Cox风险回归模型中，进行鳞癌或腺癌的肺癌病理类型、淋巴结转移、肿瘤直径和TLR9表达对肺癌术后放疗生存的预测分析，见表3。结果显示淋巴结转移和TLR9表达是肺癌术后放疗生存的独立预测因素(P值分别为0.020和0.003)，淋巴结转移的相对危险度为2.809，TLR9表达的相对危险度为4.603，表明淋巴结转移和TLR9表达是预测肺癌术后放疗生存的风险因子。

表3 肺癌术后放疗生存的Cox回归结果

3 讨论

TLR9属于胞内受体，主要识别细菌和病毒DNA中的非甲基化CpG DNA配体，是TLRs的主要成员之一。已有研究证明[1-6]，TLR9在乳腺癌、胃癌、肠癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌组织中表达增加，通过上调TLR9表达，一方面可以激活核转录因子AP-l、NF-κB促进肿瘤的生长，另一方面通过炎症介质合成增加参与肿瘤微环境的形成，从而促进肿瘤发生、增殖、侵袭和转移，进而影响肿瘤的临床分期[7]。

本研究针对63例肺癌患者，利用免疫组化SP法检测TLR9蛋白表达，结果TLR9蛋白在正常肺泡细胞中未见表达；而在肺癌组织中的阳性表达率为68.3%(43/63)，其中TLR9强阳性表达5例(见图1)；进一步将肺癌患者以性别、年龄、吸烟史、病变部位、肿瘤病理类型、肿瘤分化程度、肿瘤直径、淋巴结有无转移、TNM分期和术后有无放疗进行分组，比较组间TLR9表达，结果发现肿瘤直径、淋巴结有无转移与TLR9表达相关，肿瘤直径越大和发生淋巴结转移者，TLR9阳性率越高。而由于本研究例数较少，尽管与肿瘤TNM分期相关性的结果无统计学意义，但是P值达到0.056，因此更倾向于TLR9表达可能与肺癌TNM分期的存在相关性，与Qiu等[8]对乳腺癌TLR9在肿瘤体积大、有淋巴结转移以及分期较晚的患者中表达增强的结果相一致；在与肺癌性别、年龄、病理类型(鳞癌或腺癌)和肿瘤分化程度的相关性的统计学分析中，差异无统计学意义。

放射治疗是肺癌最重要的局部治疗手段，理论上术后放疗能有效增加肿瘤局部的控制率，减少局部肿瘤复发和远处转移的发生。Douillard等[9]研究中，840例非小细胞肺癌患者有232例接受术后放疗，仅有术后病理N2期(pN2)患者能从术后放疗中获得生存优势，其5年生存率提高仅有13%，多数患者最终死于肿瘤局部复发或淋巴结多发转移，因此肺癌术后放疗结果的影响因素仍不明朗。本研究团队在前期研究中发现[10]，CpG ODN7909通过激活TLR9信号通路增加了放射抗拒肺癌细胞的放射敏感性，而TLR9表达状态对于肺癌术后放疗患者的生存是否有影响，这方面的临床研究还未见报道。本研究通过对36例肺癌术后放疗患者进行Kaplan-Meier生存分析，结果显示出TLR9阳性表达和肿瘤直径越大的患者PFS和OS均较短；对于发生淋巴结转移的患者，其术后放疗的OS明显缩短；传统理论认为，鳞癌属对放射治疗敏感的肿瘤，研究结果显示病理类型(鳞癌或腺癌)对术后放疗生存的PFS有影响。这无疑体现了肺癌术后放疗增加局部淋巴结转移控制率的优势，从而利于术后患者的生存。将以上影响术后放疗生存的诸因素纳入Cox比例风险模型，结果显示TLR9表达和淋巴结转移是影响肺癌术后放疗生存的独立风险因素，其相对危险度分别为4.603和2.809，因此TLR9高表达和发生淋巴结转移均不利于肺癌术后放疗患者的生存，TLR9则可能成为预测肺癌术后放疗生存的新的分子生物学因子。

通过本研究可以看出，TLR9信号通路的激活与肺癌肿瘤大小以及发生淋巴结转移关系密切，并且对肺癌术后放疗的预后产生影响。因本研究例数较少，统计数据可能出现偏差，希望今后针对更大样本量进行深入的研究。

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