髓样分化因子88抑制剂ST2825对重组耻垢分枝杆菌感染THP-1细胞自噬的影响

胡少婷，李升锦，黄秦

（重庆医科大学附属第二医院呼吸内科，重庆 400010）

·论著·

髓样分化因子88抑制剂ST2825对重组耻垢分枝杆菌感染THP-1细胞自噬的影响

胡少婷，李升锦，黄秦

（重庆医科大学附属第二医院呼吸内科，重庆 400010）

目的探讨髓样分化因子88抑制剂ST2825对重组耻垢分枝杆菌感染THP-1细胞自噬的影响。方法使用髓样分化因子88抑制剂ST2825作用于重组耻垢分枝杆菌感染的THP-1细胞，确定ST2825干预的实验组、无ST2825作用的对照组以及空白组。运用荧光显微镜观察自噬小体，RT-PCR检测Beclin-1基因和Bcl-2基因的mRNA的表达。结果与对照组比较，实验组的自噬荧光小点数目明显减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）；RT-PCR检测结果显示Beclin-1和Bcl-2mRNA表达较对照组下调。结论髓样分化因子88抑制剂ST2858可能通过干扰Beclin-1和Bcl-2的分离，抑制THP-1细胞自噬。

髓样分化因子88；ST2825；重组耻垢分枝杆菌

自噬是巨噬细胞执行免疫防御的重要手段，巨噬细胞通过自噬可杀灭入侵的病原微生物，其中包括结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）。在结核分枝杆菌感染的巨噬细胞内，在自噬相关基因的调控下，形成自噬体结构。自噬体形成后可与溶酶体融合，并借助于溶酶体酸性环境降解入侵的MTB，达到免疫防御的目的。MTB以及其组成成分，可通过Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）识别后激活机体免疫反应。髓样分化分子88（myeloid differentiation factor 88，Myd88）是TLRs信号途径的重要转载分子，ST2825是Myd88特异性免疫抑制剂，可阻断TLRs信号转导［1］。本研究通过观察Myd88抑制剂ST2825对重组耻垢杆菌感染THP-1细胞形成自噬小体、自噬相关基因表达的影响，探讨Myd88在调节细胞自噬中的作用，为寻求以Myd88为作用点研究新的抗结核药物加强宿主巨噬细胞自噬作用，更有力清除机体内MTB提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料

重组耻垢杆菌MS-pMV-eis（重庆医科大学附属第二临床学院检验科保存）、LB培养基（重庆医科大学附属第二临床学院中心实验室）、人单核巨噬细胞THP-1细胞（重庆医科大学附属第二临床学院中心实验室）、自噬体荧光表达质粒GFP-LC3质粒（重庆医科大学附属第二临床学院检验科保存）、pCDNA3.1-3flag质粒（重庆医科大学附属第二临床学院检验科保存），Beclin-1引物和Bcl-2引物（大连宝生物公司）、RNA提取剂（大连宝生物公司）、细胞培养用1640培养基+胎牛血清（Hyclone）、雷帕霉素（上海生物工程有限公司）、PMA（Sigma公司）、ST2825（美国MCE公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培养：从平板上挑取MS-pMV-eis，接种于卡那霉素抗性的LB培养基（烧瓶），在37℃下震荡培养下培养7 d，取对数生长期细菌用RMPI1640培养液重悬浮，调整浓度为1×105/mL。

1.2.2 THP-1细胞的制备及培养：采用含有10%胎牛血清的RMPI1640培养液，于37℃、5%CO2培养箱中培养THP-1细胞，加入PMA培养24 h使细胞分化为贴壁的巨噬细胞，弃去培养液，调整为1×104/mL铺于6孔板。

1.2.3 重组耻垢分枝杆菌感染细胞模型的制备：THP-1细胞标本分为3组：实验组（THP-1细胞+MS-pMV-eis）、对照组（THP-1细胞+MS-pMV-eis）、空白组（THP-1细胞）。按感染复数（multiplicity of infection，MOI）10∶1的比例以MS-pMV-eis感染实验组及对照组的THP-1细胞，继续培养48 h。

1.2.4 药物干预：上述细胞和细菌共培养48 h后，将实验组细胞弃去培养液，加入浓度为20 μmol/L ST2825，继续培养24 h。

1.2.5 自噬体检测：上述各组细胞将空质粒pCDNA3.1-3flag质粒（0.4 μg）与GFP-LC3质粒（0.4 μg）共转染细胞，具体转染方法按试剂说明书进行。转染6 h后换液，荧光显微镜下观察各组细胞中自噬荧光小点的形成数目。

1.2.6 RT-PCR检测自噬基因Beclin-1和抑制自噬基因Bcl-2的表达水平：上述各组细胞收集后运用RNA提取试剂提取总RNA。GAPDH及Beclin-1、Bcl-2引物序列由大连宝生物合成，以GAPDH作内对照（表1）。PCR扩增条件：94℃5 min；94℃40 s，56℃30 s，72℃32 s，共35个循环；72℃10 min。反应结束后，取反应液1 μL进行琼脂糖胶电泳，确认RT-PCR产物。

1.3 统计学处理

表1 各基因引物序列Tab.1 Gene primer sequences

2 结果

2.1 ST2825影响自噬小体表达情况

荧光显微镜下发现实验组和对照组细胞均可观察到自噬荧光小点，但在ST2825作用下，THP-1细胞中自噬荧光小点数目明显减少（7±2），而对照组细胞中自噬荧光小点数目较多（112±3），2组差异有统计学意义（P＜0.05），表明Myd88在THP-1细胞的自噬形成过程中起着重要作用（图1）。

2.2 ST2825影响Beclin-1和Bcl-2mRNA表达情况

用RT-PCR在RNA水平上检测Beclin-1和Bcl-2 mRNA的表达，结果发现使用ST2825处理细胞后，实验组的Beclin-1和Bcl-2的条带较对照组变暗变窄，表示上述基因的表达较对照组明显下调，表示Myd88影响其表达，见图2。

3 讨论

自噬作为胞内物质降解的通路，在机体的抗感染免疫中发挥着重要作用，尤其在对抗MTB等胞内病原体感染过程中，宿主细胞可以通过自噬识别并靶向清除胞内菌。近期研究发现TLRs能够识别MTB及其组分，直接启动天然免疫，也可以同时上调抗原提呈细胞表面的主要组织性复合物Ⅱ分子和共刺激分子的表达，诱导抗原特异性免疫应答。现国外研究发现TLRs可介导自噬，并增强巨噬细胞的杀菌效应。Shin等［2］报导MTB的脂蛋白LpqH与巨噬细胞表面的TLR2/CD14结合，可启动AMPK和p38-MAPK信号途径，启动抗菌肽，抗菌肽表达后可诱导自噬相关基因及蛋白的表达，形成自噬小体。除TLR3外，其他TLR都完全或部分依赖于Myd88转到信号，因此Myd88是TLRs途径的关键分子点。阻断Myd88依赖性信号通路，增加宿主感染化脓性细菌、疱疹病毒的机会［3］。

图1 荧光显微镜下观察各组THP-1细胞的自噬小体的表达 ×40Fig.1 Counting of autophagosomes of THP-1 cells in different groups under fluorescence microscopy×40

图2 RT-PCR检测各组THP-1细胞的Beclin-1和Bcl-2基因的mRNA的表达变化Fig.2 Expression of Beclin-1mRNA and Bcl-2mRNA in THP-1 cells detected by RT-PCR

Myd88在1900年首次认为是髓样分化初级反应的基因，本质上是一种胞质可溶性蛋白，其结构上有3个功能区域：N端死亡区域（death domain，DD）、中间区域、C端区域。它的DD区类似于IL-1受体的胞质区，通过招募链接蛋白传递信号；中间区域与白细胞介素1受体相关激酶（interleukin-1 receptor associated kinase，IRAK）作用有关，在TLR信号通路中能诱导启动NF-κB、P38、JNK［4，5］。已有实验证明，myd88基因在抵御及清除卡介苗方面发挥重要作用。德国研究者敲除小鼠Myd88基因后，与正常组感染相同数量的卡介苗5 d后，CT检查发现基因敲除组小鼠的肺、肝脏、脾脏均可看到荧光素阳性区域，而正常组未发现［6］。有学者［1］发现敲除小鼠Myd88基因的外显子1和2部分，其鼠感染卡介苗后不能清除卡介苗，表示该小鼠清除卡介苗的能力被破坏［7］。

本实验以设计ST2825干预重组耻垢分枝杆菌感染THP-1细胞的模型，观察Myd88特异性抑制剂ST2825对THP-1细胞自噬的影响，试图为研究以Myd88为作用点的药物调节自噬，增强机体抗结核效应提供依据。既往Loiarro等［1］已经证明ST2825是以Myd88 TIR域BB环七肽为模板进行合成的，能特异性抑制Myd88的TIR区域的同源二聚化作用及下游信号分子IL-1受体相关激酶4（interleukin-1 receptor assiociated kinase4，IRAK4）、IRAK1活性，进而不能激活NF-κB、P38和JNK信号途径。我们的实验结果发现，重组耻垢杆菌感染的THP-1细胞在荧光显微镜下可观察到大量的自噬小体，而加入ST2825干预后，自噬小体数量明显减少。同时运用RT-PCR检测检测自噬相关基因Beclin-1和抑制自噬基因Bcl-2的mRNA表达水平，发现实验组两基因的mRNA表达较对照组下调明显。上述实验结果表示ST2825可抑制自噬的形成，并干预Beclin-1基因和Bcl-2基因的表达。本研究结果说明Myd88可调节THP-1细胞自噬形成及相关基因的表达。之前Shi等［8］将shRNAs沉默Myd88基因，用LPS刺激该基因沉默的RAW264.7细胞，在电子显微镜下观察到正常组的自噬小体数目明显高于基因沉默组，与本研究结论相一致。Bcl-2作为抗凋亡蛋白，在正常情况下与Beclin-1持续结合，抑制自噬，而进一步运用免疫共沉淀方法发现Myd88可干预Beclin-1和Bcl-2的分离，诱导自噬的发生［8］。在本实验中发现Myd88抑制剂ST2825可导致THP-1细胞的Beclin-1基因和Bcl-2基因的表达下调，证实了Shi等［8］的研究观点。故我们推测ST2825通过干扰Beclin-1和Bcl-2的分离抑制自噬。

［1］Loiarro M，Capolunghi F，Fantò N，et al.Pivotal advance：Inhibition of MyD88 dimerization and recruitment of IRAK1 and IRAK4 by a novel peptidomimetic compound［J］.Leuko Biol，2007，82（4）：801-810.

［2］Shin DM，Yuk JM，Lee HM，et al.Mycobacterial lipoprotein activates autophagy via TLR2/1/CD14 and a functional vitamin D receptor signaling［J］.Cell Microbiol，2010，12（11）：1648-1665.

［3］Netea MG，Wijmenga C，O'Neill LA.Genetic variation in Toll-like receptors and disease susceptibility［J］.Nat Immunol，2012，13（6）：535-542.

［4］吴燕燕，王易.Toll样受体信号通路中MyD88的研究进展［J］.免疫学，2012，28（3）：262-265.

［5］Warner N，Núñez G.MyD88：A critical adaptor protein in innate immunity signal transduction［J］.J Immunol，2013，190（1）：3-4.

［6］Berod L，Stüve P，Swallow M，et al.MyD88 signalling inmyeloid cells is sufficient toprevent chronic mycobacterial infection［J］.Eur J Immunol，2014，44（5）：1399-1409.

［7］Gais P，Reim D，Jusek G，et al.Cutting edge：divergent cell-specific functions of MyD88 for inflammatory responses and organ injury in septic peritonitis［J］.Immunology，2012，188（12）：5833-5837.

［8］Shi CS，Kehrl JH.MyD88 and trif target Beclin 1 to trigge autophagy in macrophages［J］.Biol Chem，2008，283（48）：33175-33182.

（编辑武玉欣）

The Effect of Myeloid Differentiation Factor 88 Inhibitor ST2825 on the Autophagy of THP-1 Cells Infected with Recombinant Mycobacterium smegmatis

HU Shao-ting，LI Sheng-jin，HUANG Qin

（Department of Respiratory Medicine，The Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400010，China）

Objective To investigate the effect of myeloid differentiation factor88 inhibitor ST2825 on the autophagy of THP-1 cells infected by recombinant mycobacterium smegmatis.MethodsThe myeloid differentiation factor 88 inhibitor ST2825 was applied on the THP-1 cells infected by recombinant mycobacterium smegmatis，and three groups were defined：the test group with ST2825 treatment，the control group without ST2825 treatment，and the blank group.Autophagosomes were observed under the fluorescence microscope，and the mRNA expression of Beclin-1gene and Bcl-2gene was analyzed by RT-PCR.ResultsCompared with the control group，the number of autophagy fluorescent dots in the test group was obviously reduced（P＜0.05），and the expression levels of Beclin 1 gene and Bcl-2 gene were declined as indicated by the RT-PCR detection.ConclusionThe myeloid differentiation factor 88 inhibitor ST2825 might inhibit the autophagy of THP-1 cells through interfering the separation of Beclin-1 and Bcl-2.

myeloid differentiation factor 88；ST2825；recombinant mycobacterium smegmatis

R372

A

0258-4646（2015）06-0562-04

胡少婷（1989-），女，硕士研究生.

李升锦，E-mail：lsj1025@163.com

2015-01-03

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