白花蛇舌草总黄酮对BGC-823胃癌细胞增殖和凋亡的影响

王秋兰，高晓民，张 煦

(1. 甘肃中医药大学临床医学院，甘肃 兰州 730000；2. 兰州大学病理研究所，甘肃 兰州 730000)

白花蛇舌草总黄酮对BGC-823胃癌细胞增殖和凋亡的影响

王秋兰1，高晓民2，张 煦2

(1. 甘肃中医药大学临床医学院，甘肃 兰州 730000；2. 兰州大学病理研究所，甘肃 兰州 730000)

目的 探讨白花蛇舌草总黄酮对BGC-823胃癌细胞增殖和凋亡的影响。方法 采用MTT法检测3.125，6.25，9.375，12.5，25.0及50.0 μg/mL白花蛇舌草总黄酮作用24 h及48 h对BGC-823胃癌细胞的抑制率，流式细胞仪检测白花蛇舌草总黄酮对细胞周期及细胞凋亡的影响。结果 作用24 h，白花蛇舌草总黄酮3.125,6.25 μg/mL对BGC-823胃癌细胞无明显抑制作用，9.375，12.5，25，50 μg/mL有明显抑制作用，其中12.5 μg/mL抑制率最高为51.5%,同期1μg/mL顺铂组为82.4%；作用48 h，白花蛇舌草总黄酮3.125,50 μg/mL对BGC-823胃癌细胞无明显抑制作用，6.25,9.375,12.5,25 μg/mL对BGC-823胃癌细胞均有明显抑制作用，其中12.5 μg/mL抑制率最高为67.3%,同期1μg/mL顺铂组为85.4%。实验各组48 h抑制率均高于24 h。经白花蛇舌草总黄酮梯度药物处理的BGC-823胃癌细胞悬浮死亡，且随药物浓度的增加悬浮死亡的细胞增多，细胞呈现凋亡特征。白花蛇舌草总黄酮试验组与对照组比较，G1期细胞增加,S期细胞明显减少，凋亡细胞比例明显增高。结论 白花蛇舌草总黄酮对BGC-823胃癌细胞的生长增殖有明显抑制作用，并表现出一定范围内的时-效及量-效关系，作用机制可能与抑制DNA的合成、诱导细胞凋亡有关。

白花蛇舌草；总黄酮；BGC-823胃癌细胞；增殖；凋亡

白花蛇舌草(HedyotisdiffusaWild)系茜草科耳草属植物, 为带根全草，别名蛇舌草，具有清热解毒、利湿、消肿镇痛、抗癌，增强免疫之功效[1]。白花蛇舌草总黄酮是从白花蛇舌草中提取的有效成分，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤的作用[2-4]。目前该成分的提取工艺已取得较大发展，相关研究众多[5-6]，而其临床应用有待拓展。笔者观察了白花蛇舌草总黄酮体外对人BGC-823胃癌细胞增殖和凋亡的影响，现将结果报道如下。

1 实验资料

1.1材料 白花蛇舌草购于兰州安宁医药公司，经甘肃中医学院中药鉴定教研室林丽老师鉴定为茜草科耳草属白花蛇舌草干燥全草。乙醇回流法提取白花蛇舌草总黄酮，AB-8型号大孔吸附树脂(沧州宝思吸附材料科技有限公司)进行纯化，总黄酮纯度约为23.82%，用DMEM配置成100 μg/mL的溶液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，分装，4 ℃保存。芦丁对照品(中国食品药品检定研究院，批号：201207)，顺铂(齐鲁制药有限公司)，BCG-823胃癌细胞株(甘肃中医药大学李海龙老师惠赠)，MTT、二甲基亚砜(DMSO)(Sigma 公司),DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(美国HyClone公司)。Annexin V-FITC /PI凋亡检测试剂盒(南京凯基生物公司)，碘化丙啶(Sigma公司)。酶标仪(ELX-800，美国BIO-TEK公司)；流式细胞仪(美国 Beckman Coulter公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞增殖的检测 MTT法检测BGC-823胃癌细胞增殖情况。收集对数生长期的BGC-823胃癌细胞，胰酶消化制成细胞悬液，计数后按1.0×107L-1细胞浓度100 μL加入96孔平底板，5%CO2，37 ℃下孵育，倒置显微镜下观察，细胞贴壁后，加入白花蛇舌草总黄酮梯度药物，使其中浓度分别为3.125,6.25,12.5,25.0,50.0 μg/mL，每孔100 μL,设5个复孔，同时设置培养基、药物调零孔、同体积PBS对照孔及1 μg/mL顺铂对照孔。24 h后，每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL，即0.5%MTT)，继续培养4 h。吸去孔内培养液，每孔加入150 μL DMSO，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪上于波长570 nm处测量各孔的吸光值。按下列公式计算增殖抑制率:增殖抑制率(%)=(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100 %。根据抑制率筛选药物浓度。

1.2.2 细胞形态观察 收集对数生长期的BGC-823胃癌细胞，以完全培养基调节细胞浓度为2.0×108L-1接种于培养瓶中，分为对照组和实验组，实验组在细胞贴璧培养24 h后加入梯度白花蛇舌草总黄酮，继续培养48 h，倒置显微镜下观察BGC-823胃癌细胞形态并摄片。

1.2.3 细胞周期的检测 将呈对数生长期，细胞密度为70%的BGC-823胃癌细胞分为3组，加入PBS为阴性对照组，1 μg/mL顺铂为阳性对照组，用最佳抑菌浓度白花蛇舌草总黄酮作用为实验组，细胞数约1.0×106个，24 h后PBS洗涤，4 ℃条件下70%乙醇固定，过夜，PI染色，400目尼龙网过滤后，流式细胞仪检测细胞周期变化。

1.2.4 细胞凋亡的检测 实验分2组，PBS为对照组，用9.375 μg/mL白花蛇舌草总黄酮作用24 h为实验组。采用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒严格按说明书进行细胞凋亡检测。

2 结 果

2.1各组BGC-823胃癌细胞增殖情况 作用24 h，3.125，6.25 μg/mL白花蛇舌草总黄酮对BGC-823胃癌细胞无明显抑制作用，9.375，12.5，25，50 μg/mL对BGC-823胃癌细胞有明显抑制作用，其中12.5 μg/mL抑制率最高；顺铂组抑制率更高。作用48 h， 3.125，50 μg/mL白花蛇舌草总黄酮对BGC-823胃癌细胞抑制率较低，6.25,9.375,12.5,25 μg/mL对BGC-823胃癌细胞均有明显抑制作用，其中12.5 μg/mL抑制率最高；顺铂组抑制率更高。实验各组48 h抑制率均高于24 h；12.5 μg/mL与9.375 μg/mL抑制率比较差异均无统计学意义。9.375 μg/mL为最佳抑菌浓度。见表1。

表1 各组BGC-823胃癌细胞增殖情况

注：①与对照组比较。

2.2 各组BGC-823胃癌细胞形态比较 光学显微镜下观察，未经白花蛇舌草总黄酮处理的BGC-823胃癌细胞贴壁生长良好，多边形且排列密集，细胞生长活跃，细胞边缘清晰，见图1。经白花蛇舌草总黄酮梯度药物处理的BGC-823胃癌细胞悬浮死亡，且随药物浓度的增加，悬浮死亡的细胞亦增多；细胞膜皱缩，排列稀疏，体积变小，细胞变形呈圆形或椭圆形，部分细胞呈现凋亡特征，见图2。

2.3 各组BGC-823胃癌细胞周期比较 与阴性对照组比较，实验组G1期细胞比例增加,S期细胞明显减少；与顺铂组比较，实验组G1期细胞比例相似，G2期细胞明显减少。见图3～5。

图1 对照组BGC-823胃癌细胞形态

图2 实验组9.375 μg/mL白花蛇舌草总黄酮干预48 h BGC-823胃癌细胞形态

图3 阴性对照组细胞周期

2.4 各组BGC-823胃癌细胞凋亡情况 实验组凋亡细胞比例明显高于对照组，活细胞比例明显低于对照组。见图6及图7。

3 讨 论

白花蛇舌草总黄酮抗肿瘤作用明显。王宇翔等[10]研究认为,白花蛇舌草总黄酮可明显促进Cy降低小鼠LpS和ConA诱导的脾细胞增殖反应,提高T淋巴细胞及B淋巴细胞转化能力,该总黄酮60 mg/kg可明显促进Cy降低小鼠脾脏IgM抗体形成,有增强机体细胞免疫和体液免疫作用,且对肿瘤化疗药物有一定的解毒作用。周忆新等[3]研究发现白花蛇舌草总黄酮对肝癌细胞株HepG-2形态有明显影响,并可抑制其生长并诱导其凋亡。吴杨等[11]用乙醇回流法提取白花蛇舌草总黄酮并发现其对肝癌细胞HepG-2有明显抑制作用，并且随着浓度的增大,抑制率越高；随着培养时间的延长,抑制率也增高。杨娴等[12]报道白花蛇舌草总黄酮能有效抑制黑色素瘤A375和B16细胞增殖,且具有一定的时-效和量-效关系。杨培民等[13]研究发现白花蛇舌草脂质体中的多糖和黄酮成分配伍应用,共奏“扶正祛邪”之效,符合传统中医复方“多成分、多靶点、多途径”的作用特点,从而发挥“整体效应”。张硕等[14]利用基因芯片技术研究了白花蛇舌草总黄酮抑制人肝癌细胞SMMC-7721的靶基因及其调控，结果筛选出20个总黄酮抑制肝癌细胞的有效基因，其中癌基因pim-1、rel、ras、fos、myc、met及Bcl-2显著下调,抑癌基因NF2显著上调,成纤维细胞生长因子、G蛋白耦联受体、酪氨酸蛋白磷酸化酶、转录因子12等信号转导分子显著下调，而丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号传导通路成员MAP2K6和MAP3K12、T细胞活化共刺激信号分子TNFSF9、TNFSF7基因显著上调。研究表明总黄酮抑制人肝癌细胞SMMC-7721由多个基因协调，并通过胞内、胞外信号转导途径共同完成。进一步研究表明，白花蛇舌草总黄酮在体内、体外具有抑制肝癌细胞的作用，这种作用与阻滞肿瘤细胞增殖周期，促进肿瘤细胞凋亡，提高脾淋巴细胞转化率、血清TNF-α水平，改善机体免疫环境等有关[15]。顾玉兰等[16]研究结果显示白花蛇舌草乙醇提取物能够显著抑制胃癌细胞BGC-823端粒酶的活性，并呈剂量依赖性[17]。

图4 实验组细胞周期

图5 阳性对照组细胞周期

图6 对照组BGC-823胃癌细胞凋亡情况

图7 实验组BGC-823胃癌细胞凋亡情况

本研究结果显示，9.375，12.5，25，50 μg/mL白花蛇舌草总黄酮作用24 h对BGC-823胃癌细胞均有明显抑制作用，其中12.5 μg/mL抑制率最高；6.25，9.375，12.5，25 μg/mL白花蛇舌草总黄酮作用48 h对BGC-823胃癌细胞均有明显抑制作用，其中12.5 μg/mL抑制率最高。实验各组48 h抑制率均高于24 h。12.5 μg/mL与9.375 μg/mL抑制率比较差异无统计学意义，故选择药物浓度9.375 μg/mL用于细胞周期和凋亡的检测。白花蛇舌草总黄酮对BGC-823胃癌细胞抑制作用表现出一定范围内的时间-效应及剂量-效应关系，其机制有可能是多个基因协调,包括癌基因如ras、fos、myc、met 及Bcl-2抑制,抑癌基因如NF2的激活,并通过胞内、胞外信号转导途径共同完成，如MAPK及TPK等。

本实验中，经白花蛇舌草总黄酮梯度药物处理的BGC-823细胞悬浮死亡，且随药物浓度的增加，悬浮死亡的细胞亦增多；细胞变形，部分细胞呈现凋亡特征；凋亡细胞比例明显高于对照组，活细胞比例明显低于对照组，这种作用与阻滞肿瘤细胞增殖周期、促进肿瘤细胞凋亡密切相关。另外白花蛇舌草总黄酮组G1期细胞增加,S期细胞明显减少，提示白花蛇舌草总黄酮对DNA复制有一定的抑制作用，可能通过抑制端粒酶的活性起作用，其机制有待于进一步深入研究。

[1] 江苏新医学院. 中药大辞典[M]. 上海:上海科学技术出版社,1997:674-745

[2] 王宇翎,张艳,方明,等. 白花蛇舌草总黄酮的抗炎及抗菌作用明[J]. 中国药理学通报,2005,21(3):348-350

[3] 周忆新,吴杨,顾珉. 白花蛇舌草总黄酮体外对人肝癌细胞HepG-2的作用[J]. 抗感染药学,2009,6(3):38-40

[4] 吴杨,周忆新,吴银生. 白花蛇舌草总黄酮的提取以及体外对肝癌细胞的作用[J]. 抗感染药学,2008,5(3):150-152

[5] 毛杏飞，罗佳波. 白花蛇舌草中总黄酮提取分离工艺的研究[J]. 中药材,2002,25(7):499-500

[6] 张彩霞，蔡定建，方文英. 白花蛇舌草中黄酮提取工艺的优化及其结构鉴定[J]. 安徽农业科学，2011,39(1):131-133；136

[7] 刘延吉,孙素梅,王学密,等. AB-8型大孔树脂分离纯化南果梨黄酮类化合物的研究[J]. 食品工业科技,2008(2):68-70

[8] 高红宁,金万勤,郭立伟,等. AB-8 型树脂对苦参总黄酮的吸附性能研究[J]. 中草药, 2001,32(10):887-889

[9] 杨培民,代龙,魏永利. 大孔吸附树脂分离纯化白花蛇舌草总黄酮的研究[J]. 北京中医药大学学报,2010,33(6):417-424

[10] 王宇翔,张艳,方明,等. 白花蛇舌草总黄酮的免疫调节作用[J]. 中国药理学通报,2005,21(4):444-447

[11] 吴杨,周忆新,吴银生. 白花蛇舌草总黄酮的提取以及体外对肝癌细胞的作用[J]. 抗感染药学,2008,5(3):150-152

[12] 杨娴,刘汝青,杜德荣,等. 白花蛇舌草总黄酮对黑色素瘤A375和B16细胞增殖抑制作用的研究[J]. 世界中西医结合杂志,2011,6(10)：844-847

[13] 杨培民. 白花蛇舌草抗肿瘤有效部位黄酮和多糖的纯化及其脂质体复合物的研究[D]. 北京：北京中医药大学,2011

[14] 张硕,宋衍芹,周三,等. 白花蛇舌草总黄酮抑制人肝癌细胞的靶基因调控[J]. 世界华人消化杂志,2007,15(10):1060-1065

[15] 张硕,宋衍芹,周三,等. 白花蛇舌草总黄酮对肝癌的体内外抑制作用及对小鼠移植性肝癌H22细胞增殖周期、凋亡、免疫环境的影响[J]. 世界华人消化杂志,2007,15(12):1347-1352

[16] 顾玉兰,朱海杭,卜平. 几种中药抗胃癌多药耐药性的实验研究[J]. 中药新药与临床药理,2007,18(2):114-116

[17] 王赞滔,黄艳丽,王文静. 白花蛇舌草作用于人胃癌细胞BGC-823后端粒酶的定量表达[J]. 临床输血与检验,2006,8(2):116-117

Effect of the total flavones of oldenlandia diffusa on the proliferation and apoptosis of gastric cancer cell BGC-823

WANG Qiulan1, GAO Xiaomin2, ZHANG Xu2

(1.Clinical Medical College of Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, Gansu, China; 2. Pathology Institute of Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu, China)

Objective It is to approach the influence of the total flavones of oldenlandia diffusa (TFOD) on the proliferation and apoptosis of gastric cancer cell BGC-823. Methods The inhibition of TFOD in dose of 3.125, 6.25, 9.375, 12.5, 25.0 and 50.0 μg/mL on BGC-823 cells for 24 and 48 hours were measured by MTT assay; the influence of TFOD on the proliferation cycle and apoptosis of BGC-823 was detected by Flow Cytometry. Results After 24 hours, the dose of TFOD in 3.125 and 6.25 μg/mL had no obvious inhibition, but in 9.375, 12.5, 25.0 and 50.0 μg/mL had obvious inhibitory effect, the highest inhibition rate was 51.5% that appeared in 12.5 μg/mL group, positive control group 1μg/mL cisplatin was 82.4%; after 48 hours, the dose of TFOD in 3.125 and 50.0 μg/mL had no obvious inhibition, but in 9.375, 12.5 and 25.0 μg/mL had obvious inhibitory effect, the highest inhibition rate was 67.3% that appeared in 12.5 μg/mL group, too, positive control group 1 μg/mL cisplatin was 85.4%; inhibition rate of 48 hours were higher than that of 24 hours in experimental group; BGC- 823 cells treated by TFOD in gradient, cell died, and with the increase of drug concentration, the increase in the number of cells death; cell membrane shrinked, arranged sparsely, volume contracted, cell deformed into circular or elliptic, presented apoptosis features; compared to control group, cells in G1phase of TFOD increased, and cells in S phase decreased significantly; the apoptosis cell ratio is significantly higher than that of the control group. Conclusion TFOD has inhibitory effect on gastric cancer cells BGC- 823 in vitro and shows time-effect and dose-effect relationship in a certain range; the mechanism may be related to inhibition of TFOD in DNA synthesis and inducing cell apoptosis.

oldenlandia diffusa; total flavones; gastric cancer cells BGC-823; proliferation; apoptosis

王秋兰，女，硕士，副教授,主治医师，从事肿瘤学研究。

甘肃省高等学校基本科研业务费项目(2012-5)；甘肃省自然科学基金项目(145RJZA235)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.21.004

R-33

A

1008-8849(2015)21-2289-04

2015-03-15