腺病毒介导的p53基因治疗肝癌的基础与临床研究进展

汪 猛，王丽娜，凌昌全

(1. 上海中医药大学岳阳临床医学院，上海 200437；2. 第二军医大学,上海 200433)

综 述

腺病毒介导的p53基因治疗肝癌的基础与临床研究进展

汪 猛1，王丽娜2，凌昌全2

(1. 上海中医药大学岳阳临床医学院，上海 200437；2. 第二军医大学,上海 200433)

腺病毒；p53；基因治疗；肝癌；研究进展

p53蛋白基因的失活在肿瘤形成过程中起着重要作用，是具有明确抑癌作用的基因，目前对其结构和功能的研究较为透彻。研究发现P53蛋白不仅在细胞核内能抑制肿瘤细胞，在细胞质中也能诱导癌细胞凋亡[1]。有60%以上的肿瘤存在p53基因的异常(包括点突变、等位基因缺失、重排、插入、基因融合等)[2]。而在肝癌发病过程中，p53基因的异常更是普遍存在的，Kondo等[3]用复色荧光原位杂交法发现：58.8%的肝癌p53基因是缺失的。

目前，通过腺病毒介导将人正常p53基因导入人体，去纠正p53基因的缺陷以发挥多种抗肿瘤治疗作用，已作为一种治疗方法开始应用于临床。进入人体之后，腺病毒会感染肿瘤靶细胞并把携p53治疗基因的腺病毒基因传递给细胞质和细胞核，进行p53基因的表达和翻译，从而发挥其抑癌基因的功能[4]。2004年，肿瘤基因治疗药物“今又生”已作为世界第一个重组人p53腺病毒在中国上市，它由正常人肿瘤抑制基因p53和改构5型腺病毒基因重组而成。多年来，国内外对Ad-p53治疗方法已开展了大量基础与临床研究，也包括对肝癌治疗的研究。Ad-p53作为一种有效的基因治疗制品，正逐渐发挥出重要的应用价值，现对Ad-p53治疗肝癌的研究作一综述。

1 基础研究

1.1腺病毒介导的p53基因对肝癌的抑制作用

1.1.1 Ad-p53能够明显抑制肝癌细胞的增殖 张沁宏等[5]研究发现Ad-p53对SMMC-7721细胞的抑制作用呈浓度依赖性。当Ad-p53在100MOI效靶比时，基本能完全抑制SMCC-7721细胞。感染2 d后P53蛋白表达达到高峰，SMCC-7721生长受到明显抑制。瘤内注射Ad-p53后，荷瘤裸鼠的肿瘤体积明显减小。Jong等[6]构建rAd-p53来治疗荷HuH7种植瘤裸鼠，结果表明，rAd-p53可以有效地治疗p53突变的肝细胞癌。

1.1.2 多种Ad-p53给药方式均具有明显疗效 动物实验研究的复杂性还体现在Ad-p53给药方式的多样性。除以上提及的瘤内注射给药方式外，在进行肝癌治疗时，已有学者报道了经动物模型肝动脉、门静脉以及全身静脉给药的治疗效果。有研究指出肝动脉给药效果优于全身静脉给药，如Anderson等[7]设计了经肝动脉注射rAd-p53治疗肝脏肿瘤的方案，用携突变型p53基因的肝癌细胞株MCA-RH7777构建同系鼠肝癌模型，肝动脉给予制品，结果肿瘤的生长受到明显抑制，与全身静脉给药相比，提高了肿瘤组织转基因表达，减少了全身暴露，显示出肝动脉途径传递rAd-p53的可行性。Okimoto等[8]的研究采用肝动脉、门静脉注射AdCMV-p53治疗RCN-9结肠癌肝转移荷瘤鼠，结果显示，经门静脉组肿瘤大小为(43.7±6.9)mm，大于经肝动脉组(16.0±4.9)mm，但小于阴性对照组(88.2±6.7)mm，也说明经肝动脉途径给药治疗效果优于门静脉途径，但门静脉途径也对肿瘤有部分抑制效应，并且实验中同时应用顺铂(CDDP，3 mg/kg)行腹腔注射，也未导致肝功能受损，进一步表明门脉途径的安全性。

1.1.3 Ad-p53可以提高放疗、化疗的敏感性，协同治疗肝癌 放疗、化疗是肝癌的重要治疗方法，研究发现Ad-p53还可通过提高肝癌细胞对放疗、化疗的敏感性增强抑癌作用。

1.1.3.1 Ad-p53可以提高肝癌细胞对放疗敏感性 张沁宏等[9]以rAd-p53分别感染突变型p53肝癌细胞PLC/PRF/5和野生型p53肝癌细胞SMMC-7721，发现rAd-p53能显著抑制人肝癌细胞生长、诱导细胞凋亡并提高细胞的放射敏感性，其对PLC/PRF/5细胞作用显著强于SMMC-7721细胞；表明不同内源性p53状态的肝癌细胞对rAd-p53治疗及其协同的放疗敏感性可能不同。

1.1.3.2 Ad-p53能够提高肝癌细胞对化疗的敏感性 梁云等[10]采用p53基因型不同的三种人肝癌细胞株HepG2(部分wt-p53)、Hep3B(p53-/+)和PLC/PRF/5(mt-p53)，观察携带wt-p53基因的重组腺病毒联合化疗药物争光霉素、丝裂霉素或甲氨蝶呤对肝细胞的杀伤效应，结果显示wt-p53基因能提高肝癌细胞对化疗药物的敏感性。王征旭等[11]也通过构建含人野生型p53抑癌基因的重组腺病毒载体，导入肝癌细胞系HepG2后，分别用光镜、电镜、Tunel法检测细胞凋亡的发生和在裸鼠体内的成瘤性改变。发现肝癌细胞HepG2导入野生型p53抑癌基因后，出现细胞凋亡，并对化疗药物顺铂的敏感性明显增加，且其生长受到一定程度的抑制，在裸鼠体内的成瘤性也降低。

1.1.4 Ad-p53可以联合中医药治疗肝癌 得力生注射液临床用于中晚期原发性肝癌气虚瘀滞证，消癌平临床用于食管癌、胃癌、肺癌，对大肠癌、宫颈癌、白血病等多种恶性肿瘤亦有一定疗效，亦可配合放疗、化疗及手术后治疗。张开通等[12]通过腹腔注射建立昆明小鼠H22肝癌腹水瘤模型，发现Ad-p53、得力生和消癌平均抑制H22细胞生长并减少腹水形成，Ad-p53与中药得力生、消癌平联合腹腔内给药对治疗腹水瘤有协同作用。

1.2 腺病毒介导的p53基因对肝癌抑制作用的机制 现已有多篇文献报道了Ad-p53可通过多种生物学途径抑制肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞的凋亡。其中针对肝癌，也有一些学者对其作用机制进行了探索。

Ad-p53主要通过诱导肝癌细胞的凋亡和周期阻滞从而起到抑制肝癌生长的作用。研究发现其机制与多种细胞因子的蛋白和基因的表达有关。Reister等[13]报道肝癌细胞感染Ad-p53后，P53蛋白在细胞核内表达，并伴有p21基因和Bax基因表达增强，CD95基因表达上调，可能是Ad-p53感染使细胞周期阻滞和诱导凋亡的机制。郭英等[14]报道通过表达wt-p53的重组腺病毒载体，将p53基因导入肝癌细胞株中，可导致肝癌细胞生长的明显抑制，促使细胞凋亡，并使细胞周期阻滞于G0/G1期。瘤内注射Ad-p53后移植瘤生长明显受抑制，并出现瘤组织中P53和P21蛋白表达的上调。张沁宏等[5]也通过免疫组织化学检测证实Ad-p53感染SMCC-7721细胞后48 h可高表达P53蛋白，到第5天尚可检测到弱表达的p53，Western blot法检测到经注射Ad-p53的肿瘤组织中可见P53蛋白的高表达。曲波等[15]通过在昆明鼠后肢股部皮下接种Hep-A-22肝癌细胞悬液建立动物模型，其中治疗组实验动物于荷瘤局部皮下注射介导野生型p53基因的复制缺陷型重组腺病毒液，后采用PCR-ELISA法定量检测昆明鼠肝癌组织端粒酶活性及免疫组化法观察肝癌细胞中Bcl-2蛋白的表达情况，结果发现腺病毒介导的wt-p53基因能够显著抑制肝癌的生长，明显降低端酶的活性表达，下调Bcl-2基因蛋白的生成。

2 临床研究

临床应用过程中药物的安全性和有效性是学界关注的焦点，肿瘤基因治疗的研究种目繁多，目前仅我国的腺病毒介导的p53基因治疗制品“今又生”已经正式上市。

2.1 Ad-p53治疗肝癌的临床用药途径多样 有学者认为首选途径为瘤内注射，其他给药途径也有经动脉、静脉、胆管、腔内等[16]。因Ad-p53采用无复制能力的腺病毒作为载体，体液具有对腺病毒的中和作用、存在p53抗体与P53蛋白的反应等，静脉给药途径会影响其疗效。具代表性的是在超声引导下行瘤内注射，如贡雪灏等[17]为评价超声引导下瘤体内注射重组人p53腺病毒治疗晚期难治性肝癌的临床疗效及超声导入基因治疗的临床应用价值，对57例晚期肝癌患者行超声引导下瘤体内注射重组人p53腺病毒(rAd-p53)。结果显示，超声引导瘤内注射既能控制肝癌基因治疗的靶向性，又能对基因药物疗效进行影像学评估，具有较高的临床应用价值。除瘤内注射，也有运用其他途径给药的，如Habib等[18]用wt-p53-CMV-Ad制品治疗319例无法手术切除的、携突变型p53基因的肝癌患者采用肝动脉灌注给药。结果表明：腺病毒可成功介导p53基因在肿瘤细胞中持续表达，并诱导肿瘤细胞凋亡。

2.2 Ad-p53可结合放疗、化疗等协同治疗肝癌 Ad-p53单独运用疗效有限，临床上主要是用于结合放疗、化疗、热疗，提高传统治疗的疗效。

2.2.1 Ad-p53可与放疗的联合运用 Yang等[19]通过研究评价rAd-p53与立体定向放疗联合运用治疗原发性肝癌的可行性和疗效，发现立体定向放疗组和联合治疗组的1年生存率分别为70.0%和90.0%，1年无病生存率分别为65%和85%，结果提示rAd-p53与立体定向放疗联合运用比仅行立体定向放疗更为安全、有效，这为无法手术或不愿手术的原发性肝癌患者提供了一个较好的局部疗法选择。

2.2.2 Ad-p53可与化疗联合运用 Chen等[20]将48例晚期肝癌患者随机分为2组，治疗组30例、对照组18例，所有病例均经右髂外动脉入路皮下埋植药盒系统，并根据造影表现决定灌注药物的靶动脉。治疗组在靶动脉灌注p53基因制品(今又生)加羟基喜树碱，每周1次，连续3周为1个疗程，30例患者分别接受1～8个疗程的治疗；对照组仅行肝动脉灌注羟基喜树碱。结果显示，p53基因制品经肝动脉序贯输注是安全的，能够延长患者的生存时间，联合用药能提高患者存活率。金丰等[21]通过回顾性分析358例肝癌患者，发现重组人Ad-p53注射液联合放化疗患者的中位生存时间为22个月，明显优于单独立体定向放疗患者的11个月。也有将其联合TACE治疗肝癌的，Guan等[22]采用 TACE、经皮肝瘤体内注入rAd-p53两种方法治疗150例中晚期肝细胞癌患者，其中采用经皮肝瘤体内注入rAd-p53后联合TACE治疗中晚期肝细胞癌，并与同期病情相当的中晚期肝细胞癌仅行TACE治疗相比较，有效率分别为67.6%和51.2%，白细胞下降例数少，程度轻(P=0.003)；癌性疼痛减轻程度明显(P=0.017)；治疗后Karuafsky评分有显著性差异(P=0.029)。可见，经皮肝瘤体内注入rAd-p53后联合 TACE治疗肝细胞癌，增强了抗癌效果，改善了患者的生存质量。

2.3 Ad-p53联合中医药治疗肝癌的临床应用 中医药在肝癌的防治中有着重要的作用，吴孟超院士指出，在放、化疗时，服用中药可减轻毒副反应，提高临床疗效；对不能耐受放、化疗的患者，服用中药在起到一定抑癌作用的同时，对一些并发症如黄疸、腹水、疼痛等也有一定的疗效，尤其在改善患者生存质量、延长生存期方面具有独到之处[23]。

有学者尝试将Ad-p53与中药制剂联合运用，取得较好效果。史守良等[24]将40例原发性肝癌患者随机分为联合组20例和对照组20例，观察了p53基因治疗制品联合中药治疗原发性肝癌的临床疗效，其中对照组给予速溶表柔比星联合“今又生”处理，联合组在对照组的基础上加用中药艾迪注射液治疗。联合组治疗6个月和1年的甲胎蛋白、癌胚抗原含量均低于对照组，肝功能好于对照组；治疗后1年的肝内肿瘤个数和大小均好于对照组；治疗后1年联合组Child-Pugh评分明显低于对照组。可见艾迪注射液联合今又生治疗原发性肝癌效果好，可增强p53基因治疗的效果。梁杰安[25]临床治疗与观察研究了重组人p53腺病毒注射液肝动脉灌注疗法介入对伴门脉癌栓肝癌的影响，研究组采用p53肝动脉灌注、TACE、中医药配合的综合治疗方法，对照组仅采用TACE与中医药结合的治疗方法，2组均于术后根据其肝癌类型(肝郁脾虚型、气滞血瘀型、湿热蕴结型、湿瘀搏结型、肝肾阴亏型)辨证使用中药。结果发现2组术后随访生存率差异无统计学意义，而术后的并发症发生率差异有统计学意义。提示使用中药介入对伴门脉癌栓患者实施p53灌注治疗有利于降低患者并发症发生率，减轻患者痛苦，此方法有利于提高TACE治疗伴PVTT的原发性肝癌患者的远期疗效。

3 展 望

肝癌的发病机制非常复杂，p53基因的突变或缺失在肝癌的发病过程中起着非常重要的作用。基因治疗的发展开拓了肝癌治疗研究的途径。

国内外通过导入外源性p53治疗肝癌的基础研究、临床研究都取得了很多进展，且研究形式多样、切合临床实际。虽然目前该治疗方式依然处于早期临床试验阶段，“今又生”也仍未有足够的临床试验数据来确证其抗癌效果，但诸多研究已经显示出这种疗法的运用潜力。

Roth[26]认为，在临床上，作为单一疗法，瘤内注射Ad-p53有很好的安全性，可使肿瘤缩小、生长受抑；还可用于治疗有耐药性的肿瘤，或提高放疗和化疗的疗效。p53转基因的表达位于高水平，同时能激活p53途径的其他基因。但是，其临床运用的不良反应仍值得关注，Gerolami等[27]指出，腺病毒的注射能导致病毒颗粒及转导细胞强烈的免疫反应，释放IL-6、IL-8、TNF-α等，产生急性炎症反应，从而在杀死癌细胞的过程中损伤正常的肝细胞，势必导致患有肝炎、肝硬化患者的肝功能恶化，但在瘤内、肝动脉内、静脉内低剂量给药似乎有很好的耐受性。因此，Ad-p53还需更多的研究来降低其临床运用的不良反应。

将Ad-p53与介入治疗、放疗、化疗及手术等传统治疗方式综合运用于临床，逐渐成为研究的热点，但其提高肝癌临床疗效的作用仍缺少更高级别的循证医学依据。特别值得一提的是，将基因治疗与中医药联合运用，无疑是中西医结合治疗肝癌的一种新模式，但联合应用的剂量、时间、给药途径等问题都有待更多的探索和研究。

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凌昌全，E-mail:lingchangquan@hotmail.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.21.041

R735.7

A

1008-8849(2015)21-2388-04

国家自然科学基金资助项目(81303112)；国家基础科学人才培养基金项目(J1103607)

2014-10-15