VDAC1基因在多发性骨髓瘤患者中表达的研究

梁 青,李凯丽,刘尚勤

(武汉大学中南医院，湖北 武汉 430071)

VDAC1基因在多发性骨髓瘤患者中表达的研究

梁 青,李凯丽,刘尚勤

(武汉大学中南医院，湖北 武汉 430071)

目的 研究线粒体电压依赖性阴离子通道1(VDAC1)在多发性骨髓瘤患者中的表达情况及其与骨髓瘤细胞代谢和凋亡的关系。方法 选择多发性骨髓瘤患者20例作为观察组，非肿瘤患者10例作为对照组。采用RT-PCR方法检测2组骨髓标本单个核细胞中VDAC1基因的表达情况。结果 观察组VDAC1基因表达量明显高于对照组(P<0.05)；观察组中Ⅲ期患者VDAC1基因表达量明显高于Ⅰ期及Ⅱ期患者(P均<0.05)，Ⅱ期患者高于Ⅰ期患者(P<0.05)。结论 多发性骨髓瘤患者VDAC1高表达可能与肿瘤细胞高代谢相关，对肿瘤细胞凋亡起到重要作用。VDAC1将为多发性骨髓瘤的治疗提供新的方向。

线粒体电压依赖性阴离子通道1；多发性骨髓瘤；基因表达

电压依赖性阴离子通道1(voltage-dependent anion channel，VDAC1)位于所有真核生物线粒体外膜上，是一种线粒体外膜上的孔型蛋白[1]。VDAC1在ATP和ADP的跨线粒体外膜转运中起着关键作用[2]。目前认为，线粒体依赖性细胞凋亡与多种疾病有关，如神经变性疾病、肿瘤、心血管疾病等[3]。笔者在前期实验中观察到，通过改变VDAC1在细胞中的表达，骨髓瘤细胞株的线粒体跨膜电压、药物敏感性以及凋亡均出现改变。由此，本研究对VDAC1在多发性骨髓瘤(multiple myelom,MM)患者体内的表达水平进行了检测，以探讨其与肿瘤细胞代谢、凋亡的关系。

1 研究资料

1.1 材料 选取2014年3月—2015年2月于我院血液科就诊，经细胞形态、流式免疫分型、染色体、分子遗传学诊断为多发性骨髓瘤患者骨髓标本20例作为观察组，男12例，女8例；年龄47～74岁，中位年龄60岁；根据国际分期系统(international staging system，ISS)[4]分为3期：Ⅰ期6例，Ⅱ期6例，Ⅲ期8例。选取同期住院10例非肿瘤患者骨髓样本作为对照组，男6例，女4例；年龄40～70岁，中位年龄56岁。2组性别、年龄比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。

1.2 主要试剂与仪器 淋巴细胞分离液Ficol来自于GE公司，TRIzol试剂购于美国Invitrogen公司，SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mix购自Fermentas公司，Ex Taq、DL2000 DNA Marker来自于宝生物工程TAKARA公司。PCR仪为东胜创新生物科技有限公司产品，实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 单个核细胞分离、总RNA提取与cDNA合成 取EDTA-K3抗凝的骨髓标本3 mL利用Ficoll淋巴细胞分离液梯度离心，分离出单个核细胞。应用TRIzol、按照常规方法提取RNA：收集细胞，加入1 mL Trizol裂解细胞;加入200 μL氯仿，轻轻颠倒数次混匀，室温放置5 min;4 ℃ 12 000 r/min离心15 min;转上层水相(约400 μL)于新1.5 mL EP管中，加入400 μL异丙醇，混匀，室温静置10 min、4 ℃ 12 000 r/min离心10 min;弃上清，沉淀用预冷的70%无水乙醇洗3次，空气干燥5～10 min，溶于20 μL DEPC水中;分光光度计测定RNA浓度。应用反转录酶试剂盒合成cDNA第一链。

1.3.2 引物设计 根据VDAC1基因mRNA序列设计引物(NM-)，选取保守区，设计并合成特异性引物，以人β-actin基因为内参对照。VDAC1引物序列为Homo VDAC1F: 5’- GCAGGAAACAGTAACACG -3’ ,Homo VDAC1 R:5’- AACCTATCAGGCTGGAGT -3’，扩增目的产物的片段长度为100 bp，内参对照β-actin的序列为 Homo β-actin F：5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’ ,Homo β-actin R：5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’,β-actin全长为258 bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司设计并合成。

1.3.3 PCR与定量分析 利用SYBR Green/Flourescein实时荧光定量PCR方法检测外周血单个核细胞VDAC1基因的表达情况。使用ABI实时定量PCR仪进行荧光定量PCR：cDNA(10×稀释) 4 μL，PCR Forward Primer (100 μmol/L) 0.4 μL，PCR Reverse Primer (100 μmol/L)0.4 μL，SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mix(2×)10 μL，H2O 5.2 μL。循环条件：预变性95 ℃ 30 s;然后95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s，循环反应40次，并进行溶解曲线的获取。配置2%琼脂糖凝胶，取5 μL PCR产物电泳。采用相对定量法分析2组VDAC1基因表达水平的差异。相对定量公式为：2-ΔΔCT，ΔΔCT=(CT目的基因-CT内参基因)实验组-(CT目的基因-CT内参基因)对照组。

2 结 果

2.1 PCR产物扩增特异性 目的基因VDAC1及内参对照β-actin的溶解曲线见图1及图2，均呈单峰。VDAC1的溶解温度为84.07 ℃，β-actin溶解温度为87.65 ℃，并随机取样本于2%琼脂糖凝胶电泳分析提示VDAC1的PCR片段为100 bp。

图1 目的基因VDAC1 PCR产物溶解曲线

2.2 2组VDAC1基因相对表达量比较 2组骨髓标本中VDAC1基因表达电泳结果见图3。观察组VDAC1基因mRNA相对表达量为38.478±47.891，对照组为4.963±4.523，观察组表达量明显高于对照组(t=-2.501，P<0.05)。

图2 内参对照β-actin PCR产物溶解曲线

1为Marker；2～7为观察组；8～10为对照组。图3 2组2%琼脂糖凝胶电泳结果

2.3 VDAC1基因在多发性骨髓瘤不同分期中的表达量 Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者VDAC1基因表达量分别为8.567±4.063，19.364±14.742，75.248±44.396。Ⅲ期患者VDAC1基因表达量明显高于Ⅰ期、Ⅱ期患者(P均<0.05)，Ⅱ期患者高于Ⅰ期患者(P<0.05)。

3 讨 论

VDAC蛋白是构成渗透性转换孔(permeability transition pore，PTP)的重要组成部分，位于线粒体外膜的VDAC与位于内膜的腺嘌呤核苷酸转运蛋白(adenine nucleotide translocator，ANT)和位于基质的环孢素A受体D(cyclophilin-D，Cyp-D)共同组成了线粒体PTP。现普遍认为PTP的高通透性开放是引发细胞死亡，尤其是凋亡的关键[5]。生理条件下，PTP呈低通透性、可逆地开放，而在病理条件下，PTP呈高通透性开放状态，引起线粒体肿胀、膜电位下降以及细胞色素C等的释放，最终导致细胞凋亡或坏死。而VDAC作为线粒体PTP的主要成分，成为启动线粒体介导的细胞死亡的重要因素[6]。

本研究结果显示，VDAC1基因在多发性骨髓瘤患者体内表达明显增加。由此推测骨髓瘤细胞的产生过程中存在VDAC1基因的过度表达，考虑肿瘤细胞在发生发展过程中，由于不断增殖，恶性肿瘤细胞糖酵解反应增加，糖酵解途径的关键酶之一己糖激酶(hexokinase，HK)会出现高表达，而HK具有凋亡抑制效应[7]，但HK的增加会导致VDAC1的上调，足够数量的VDAC1才能与HK相互结合，发挥抗凋亡的作用，进而促进肿瘤细胞继续增殖[8]。根据国际分期系统，多发性骨髓瘤Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ期患者的中位生存时间分别为62个月、44个月及29个月。本研究结果显示Ⅲ期患者VDAC1的表达水平明显高于Ⅰ期、Ⅱ期患者，进一步表明VDAC1的高表达可加速肿瘤细胞生长，甚至加速疾病进展，从而影响了患者的预后和生存时间。

线粒体凋亡途径是许多化疗药物消灭肿瘤细胞的重要机制之一。VDAC1作为线粒体膜孔道蛋白的重要组成部分，一些理化因素如化学物、病毒等刺激可使VDAC的结构或功能发生异常，导致线粒体能量代谢紊乱[9]；许多药物如抗肿瘤、脑神经药物等可以VDAC为药物靶点，发挥其治疗效应；而一些细胞内因子如Bcl-2、bax等亦可与VDAC发生相互作用，诱导细胞凋亡或抑制细胞凋亡[10-11]。因此，VDAC1的表达水平改变可以为肿瘤生物治疗提供新的方向。以VDAC1为基础的生物治疗，如VDAC1活性抑制剂或是降低与VDAC1结合的竞争性药物会对高表达VDAC1的肿瘤细胞产生良好的疗效[12]。

综上所述，VDAC1在多发性骨髓瘤患者中出现表达增加，根据这一发现，在下一阶段研究中，将通过改变骨髓瘤细胞系VDAC1的表达水平，进一步探索VDAC1在疾病进展及药物治疗中的作用，为VDAC1作为肿瘤治疗新的靶点提供更明确的依据。

[1] Shoshan-Barmatz V，Mizrachi D. VDAC1:from structure to cancer therapy[J]. Front Oncol,2012,2：164

[2] Choudhary OP,Paz A,Adelman JL,et al. Structure-guided simulations illuminate the mechanism of ATP transport through VDAC1[J]. Nat Struct Mol Biol,2014,21(7):626-632

[3] Shoshan-Barmatz V,Ben-Hail D,Admoni L,et al. The mitochondrial voltage-dependent anion channel 1 in tumor cells[J]. Biochim Biophys Acta,2014,14:375-377

[4] 葛均波,徐永健. 内科学[M]. 8版. 北京：人民卫生出版社,2013：605-606

[5] Ko JH,Gu W,Lim I,et al. Expression profiling of mitochondrial voltage-dependent anion channel-1 associated genes predicts recurrence-free survival human carcinomas[J]. PLoS One,2014, 9(10):e110094

[6] Keinan N,Pahima H,Ben-Hail D，et al. The role of calcium in VDAC1 oligomerization and mitochondria-mediated apoptosis[J]. Biochim Biophy Acta,2013,1833(7):1745-1754

[7] Yuan S,Fu Y,Wang X,et al. Voltage-dependent anion channel 1 is involved in endostatin-induced endothelial cell apoptosis[J]. FASEB J,2008,22(8):2809-2820

[8] Shoshan-Barmatz V,Ben-Hail D.VDAC, a multi-functional mitochondrial protein as a pharmacological target[J]. Mitochondrion,2012,12(1):24-34

[9] Prezma T,Shteinfer A,Admoni L,et al. DAC1-based peptides: novel pro-apoptotic agents and potential therapeutics for B-cell chronic lymphocytic leukemia[J]. Cell Death Dis,2013,4:e809

[10] Aamarinah A,Paradowska-Dogan A,Kodariah R,et al. Expression of the Bcl-2 family genes and complexes involved in mitochondrial transport in prostate cancer cells[J]. Int J Oncol,2014,45(4)：1489-1496

[11] Weisthal S,Keinan N,Ben-Hail D,et al. Ca2+-mediated regulation of VDAC1 expression levels is associated with cell death induction[J]. Biochim Biophys Acta,2014,1843(10):2270-2281

[12] Sharaf el dein O,Gallerne C,Brenner C,et al. Increased expression of VDAC1 sensitizes carcinoma cells to apoptosis induced by DNA cross-linking agents[J]. Biochem Pharmacol,2012,83(9):1172-1182

Study on expression of VDAC1 gene in patients with multiple myeloma

LIANG Qing, LI Kaili, Liu Shangqin

(Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, Hubei, China)

Objective It is to investigate the expression of voltage-dependent anion channel 1(VDAC1) in patients with multiple myeloma so as to explore its relationship with tumor cell metabolism and apoptosis. Methods 20 patients with multiple myeloma were selected into observe group and 10 cases of non tumor patients were into control group. The expressions of VDAC1 gene in bone marrow mononuclear cells were detected by RT-PCR in both groups. Results The expression of VDAC1 gene in the observe group was higher than that in the control group (P<0.05). In observe group, the expression of VDAC1 gene of patients in stage Ⅲ was markedly higher than that of patients in stage Ⅰ and Ⅱ (P<0.05), and that in stage Ⅱ was markedly higher than that in stage Ⅰ (P<0.05). Conclusion The high expression of VDAC1 in patients with multiple myeloma may be related to the high metabolism of tumor cells, plays an important role in tumor cell apoptosis. VDAC1 will provide a new direction for the treatment of multiple myeloma.

voltage-dependent anion channel of mitochondrial outer membrane 1; multiple myeloma; gene expression

梁青，女，硕士研究生，研究方向为血液系统恶性肿瘤。

国家自然科学基金资助项目(81272627)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.21.003

R551.3

A

1008-8849(2015)21-2287-03

2015-03-02