去甲斑蝥素对人胰腺癌PANC-1细胞凋亡作用的研究

张日沅 林胜璋 陈翀 王盈盈 徐贤绸

去甲斑蝥素对人胰腺癌PANC-1细胞凋亡作用的研究

张日沅 林胜璋 陈翀 王盈盈 徐贤绸

目的探讨去甲斑蝥素对人胰腺癌PANC-1细胞凋亡的作用及其机制。方法将PANC-1细胞株随机分为处理组和对照组，处理组加入不同浓度的去甲斑蝥素培养24h后，CCK-8法检测细胞增殖情况；流式细胞术分析细胞的凋亡情况；免疫印迹法检测细胞内质网应激和凋亡相关蛋白的表达；荧光定量PCR技术检测细胞内质网应激和凋亡相关蛋白m RNA表达。结果不同浓度去甲斑蝥素处理PANC-1细胞24h后，与对照组相比，能降低细胞的存活率并诱导其凋亡。与对照组相比，处理组中内质网应激和凋亡相关蛋白的表达水平均上调（均P＜0．05），同时其m RNA的表达水平亦均上调（均P＜0．05）。结论去甲斑蝥素能明显抑制人胰腺癌PANC-1细胞的生长并诱导其凋亡，并且具有浓度依赖性，这一作用可能是通过内质网应激介导的凋亡途径实现的。

胰腺癌 去甲斑蝥素 凋亡 内质网应激

胰腺癌是一种恶性程度极高的消化道肿瘤，其起病隐袭，病情进展迅速，且早期诊断率低，预后差[1]。近年来寻找新型的抗肿瘤药是治疗肿瘤的趋势[2]。体内外研究证实中药单体能高效、安全地抑制肿瘤细胞增殖，并且无肝肾功能损害，不引起骨髓抑制还能增强免疫功能。本研究探讨中药单体去甲斑蝥素抗胰腺癌的机制，为其治疗胰腺癌提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料 去甲斑蝥素（美国Sigma公司）；人胰腺癌细胞系PANC-1（中国科学院上海细胞库）；胎牛血清（杭州四季青公司）；青霉素-链霉素（北京索莱宝科技有限公司）；DMEM培养基（美国Gibco公司）；细胞增殖检测试剂盒（CCK-8 kit）（日本Dojindo公司）；Annexin VFITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（美国BioVision公司）；小鼠抗人GADD153抗体、小鼠抗人ATF4抗体、兔抗人GRP78抗体（英国Abcam公司）；兔抗人phospho-PERK（Thr980）抗体、兔抗人phospho-eIF2α（Ser51）抗体、兔抗人cleaved caspase-3（Asp175）抗体、兔抗人β-tubulin抗体（美国CST公司）。

1.2 方法

1.2.1 PANC-1细胞培养 PANC-1细胞在含10%灭活胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/m l链霉素的DMEM培养基中，于37℃、5%二氧化碳条件下培养。使用容积为60ml、培养面积为25cm2的斜颈带滤膜的培养瓶培养，盛约5ml的完全培养基。细胞呈单层贴壁生长，生长至80%～90%时传代。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖 收集对数生长期PANC-1细胞，接种于96孔培养板中常规培养。每孔总体积100μl，细胞培养24h后加药物处理，分对照组（0.1%DMSO溶液）和处理组；处理组再根据添加的去甲斑蝥素浓度分为A组（10μmol/L）、B组（50μmol/L）、C组（75μmol/L）、D组（100μmol/L）、E组（150μmol/L）、F组（200μmol/L）；每组设6个复孔，继续培养24h。然后每孔加入10μl的CCK-8溶液和100μl不含血清的培养基，培养4h，酶标仪测A450值，实验重复3次，计算24h细胞存活率[细胞存活率=（处理组A450值-空白调零A450值）/（对照组A450值-空白调零A450值）×100%]。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 取对数生长期PANC-1细胞，接种于6孔培养板中常规培养。细胞培养24h后加药物处理分组（分组法同前），实验重复3次。将细胞重悬于500μl Binding buffer中，加入5μl Annexin V-FITC和10μl PI，室温下避光孵育5min后在流式细胞仪上进行检测。流式细胞仪激发光波长用488 nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长＞560nm的滤器检测PI。

1.2.4 Western blot检测蛋白表达 于6孔板中收集对数生长期PANC-1细胞，药物处理分组（分组法同前），细胞裂解液作用后，提取细胞总蛋白，采用BCA蛋白质定量试剂盒测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳，转膜，之后将PVDF膜置于5%脱脂奶粉中室温封闭1.5 h，并置于内质网应激和凋亡相关蛋白GRP78、phospho-PERK、phospho-eIF2α、ATF4、GADD153、cleaved caspase-3和内参蛋白β-tubulin中参与免疫反应，最后化学发光、显影、定影，胶片扫描，以各蛋白与β-tubulin灰度比值表示蛋白表达水平。

1.2.5 荧光定量PCR 收集对数生长期PANC-1细胞，接种于6孔培养板中常规培养。细胞培养24 h后加药物处理分组（分组法同前）。实验重复3次。进行RNA提取以及RNA浓度的测定，采用美国Fermentas公司的RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit进行逆转录，采用日本Toyobo公司的SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus-试剂盒进行PCR扩增，检测基因表达水平。

1.3 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件，计量资料以表示，多组间比较采用方差分析，组间比较采用LSD-t检验。

2 结果

2.1 各组PANC-1细胞24h存活率、凋亡率的比较 见表1。

表1 各组PANC-1细胞24h存活率、凋亡率的比较（%）

由表1可见，除A组外，处理组与对照组的细胞24h存活率、凋亡率比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；并且，去甲斑蝥素对PANC-1细胞24h存活率的半抑制浓度约100μmol/l。

2.2 Western blot检测各组PANC-1细胞内质网应激和凋亡相关蛋白表达水平 见图1、表2。

图1 Western blot检测各组PANC-1细胞内质网应激和凋亡相关蛋白表达水平电泳图

由图1可见，处理组较对照组Western blot结果蛋白表达灰度高。由表2可见，除A组外，处理组较对照组GRP78、phospho-eIF2α、phospho-PERK、ATF4、cleaved caspase-3蛋白的表达水平均上调（均P＜0.05）；除A、B、C组外，D、E、F组较对照组GADD153蛋白的表达水平均上调（均P＜0.05）。

2.3 各组PANC-1细胞内质网应激和凋亡相关蛋白mRNA表达水平比较 见表3。

由表3可见，除A组外，处理组与对照组比较，PANC-1细胞GRP78、phospho-eIF2α、phospho-PERK、ATF4、cleaved caspase-3mRNA的表达水平均上调（均P＜0.05）；除A、B、C组外，D、E、F组较对照组GADD153 mRNA的表达水平亦均上调（均P＜0.05）。

表2 各组PANC-1细胞内质网应激和凋亡相关蛋白表达水平比较

表3 各组PANC-1细胞内质网应激和凋亡相关蛋白mRNA表达水平比较

3 讨论

去甲斑蝥素是从传统中药中提取并经人工合成的一种新型低毒的抗肿瘤药物，具有较强的抗肿瘤活性和独特的升高血白细胞作用。去甲斑蝥素抑制肝癌和结肠癌等肿瘤细胞的增殖,可能机制是诱导细胞凋亡[3-4]，但对于其抗胰腺癌作用的机制仍没有完全的认识。本研究观察了去甲斑蝥素对人胰腺癌PANC-1细胞增殖和凋亡的影响，结果显示，去甲斑蝥素对PANC-1细胞的生长有明显抑制作用，并呈浓度依赖关系。流式细胞术检测结果显示去甲斑蝥素可通过诱导细胞凋亡而发挥抑制PANC-1细胞生长的作用。

介导肿瘤细胞凋亡的途径很多，内质网应激介导的凋亡途径是一种新的凋亡途径[5-7]。内质网是各种分泌蛋白和膜蛋白合成与折叠的一种细胞器。多种生理或病理情况下，例如蛋白质糖基化的抑制、蛋白质不能形成正常的二硫键结合、突变蛋白表达以及氧化还原状态的改变等均会引起未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网聚集，损伤内质网的正常生理功能，称为内质网应激（ERS）[8]。发生ERS时，细胞内GRP78结合未折叠或错误折叠蛋白质，诱发非折叠蛋白反应，激活ERK/eIF2α/ ATF4、ATF6和IRE-1/XBP-1 3条信号途径，增强对蓄积在内质网内的未折叠或错误折叠蛋白质的处理能力，以利于维持细胞的正常功能[9]。其中，GRP78是ERS的标志性特异分子。如果细胞损伤太过严重或时间太过长久，内环境稳定不能及时恢复，ERS可以激活下游的凋亡信号分子GADD153，诱导细胞凋亡，从而去除受损伤的细胞[10]。以此假设：去甲斑蝥素亦可通过ERS介导的凋亡途径诱导胰腺癌细胞凋亡。Western blot和荧光定量PCR结果显示，去甲斑蝥素明显上调GRP78蛋白和基因的表达水平，并且GRP78上调的水平和细胞凋亡的水平一致。此外Western blot结果还显示，ERS的其他反应蛋白，如磷酸化PERK、磷酸化eIF2α和ATF4在经去甲斑蝥素处理PANC-1细胞中表达明显增高。这些结果表明ERS在去甲斑蝥素诱导的PANC-1细胞凋亡中起了重要作用。

综上所述，本研究显示去甲斑蝥素对PANC-1细胞具有生长抑制和凋亡诱导的作用，其可能的机制是去甲斑蝥素可通过ERS介导的凋亡途径诱导PANC-1细胞凋亡。此结果对去甲斑蝥素在抗胰腺癌的临床应用及其机制研究有指导作用。本实验仅在体外条件下研究了去甲斑蝥素对人胰腺癌PANC-1细胞的生长抑制和凋亡诱导作用及其机制，还需完成在动物体内进一步的实验研究。

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ObjectiveTo investigate the effect of norcantharidin on human panc reatic cancer PANC-1 cells． Methods PANC-1 cells were cultured w ith 0．1%DMSO and norcantharid in(0,10,50,75,100,150,200μmol/L)for24h．The grow th inhibitory effectwas observed by using CCK-8,cellapop tosis was determ ined by flow cytometry(FCM)．The exp ressions of endop lasm ic reticulum stress(ERS)markers were detected byWestern b lot,exp ressions ofGRP78 and GADD153m RNAwere detected by real-time PCR afterexposure to norcantharid in．ResultsCCK-8 assay showed thatnorcantharidin significant inhibited the grow th of PANC-1 cells．Apop tosis rates of PANC-1 cells treated w ith norcantharid in were significantly higher than those of control g roup．Western b lotanalysis showed that norcantharidin up-regulated ERSmarkers(P＜0．05)．Real-time PCR showed that the exp ression ofGRP78 and GADD153mRNA in PANC-1 cells treated w ith norcantharid in was higher than thatof controlgroup(P＜0．05)．ConclusionNorcantharid in can inhibit the g row th of human pancreatic cancer PANC-1 cells and induce cell apop tosis．ERS-mediated apop tosis pathwaymay be involved in norcantharid in-induced apop tosis in pancreatic cancer PANC-1 cells．

Pancreatic cancer Norcantharid in Apop tosis Endop lasm ic reticulum stress

2014-03-26）

（本文编辑：李媚）

325027 温州医科大学附属第二医院普外科（张日沅、林胜璋，张日沅为研究生，现在平阳县人民医院普外科工作）；平阳县人民医院普外科（陈翀、王盈盈、徐贤绸）

张日沅，E-mail：pyzry2013@163.com