病原微生物检测技术进展

张艳秋

病原微生物检测技术进展

张艳秋

快速鉴定病原微生物的检验技术的更新换代非常迅速，其主要原因在于微生物的生理特性，它们种类繁多且变异迅速。对病原体进行快速、准确的检测是十分必要的。常规的检测方法操作复杂，耗时长，且对操作人员的要求极高，已经远远不能满足现在对各种病原体的诊断和流行病学研究，微生物检测技术必须得到快速发展，才能适应未来发展的要求。

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病原学诊断已从病原体水平，深入到分子水平、基因水平，如PCR技术、基因芯片技术等。这些技术通过自动化完成检测，耗时短，准确性和灵敏度都很高。这样的现代生物科学技术能够对病原微生物做出及时的诊断和鉴定，可大大减少人类对其感染的致病率和死亡率。本文对一些微生物检测技术进行简要介绍。

1　病原微生物检测传统方法

病原微生物传统的实验室检查方法是将标本涂片染色后在显微下进行镜检和采用在培养基上接种后进行分离培养。

1.1涂片镜检

由于传统的镜检方法方便快捷，因此对于类似螺旋体感染、淋球菌感染、结核分枝杆菌等具有特殊形态病原微生物感染的初步诊断，实验室里仍然将镜检方法作为重要检测手段。

1.2分离培养

分离培养用于从检验标本或培养物的多种细菌中分离出某一种细菌的检验，但传统的分离培养方法存在着检测周期较长且不能批量处理样本的缺陷。随着检验设备的技术性进步，目前生产出的自动培养和鉴定系统克服了传统方法的缺陷，较先进的全自动微生物分析仪，不但可以批量处理，而且可同时做细菌鉴定和药敏试验缩短了检测周期。

2　酶联免疫与免疫磁珠分离技术

2.1酶联免疫

酶联免疫测试技术是通过已知的抗体或抗原检测病原体的抗原或抗体的一种血清学检测技术，此技术可以对病原体进行快速鉴定。酶联免疫技不但可以检测样本中病原体抗原，而且可以检测机体的抗体成分，此技术的应用在很大程度上提升了血清学检测的特异性和敏感性，全自动免疫分析仪就因其具有高灵敏度和耗用时间短的特点而受到重视。

2.2免疫磁珠分离技术

免疫磁珠分离技术（IMBS）是将特定病原体的单抗或多抗或二抗偶联到磁珠微球上并通过抗原抗体反应形成磁珠，通过外部磁场磁力，将目标病原体分离出来的微生物检测技术。作为微生物检测领域中的一种新技术，IMBS在近年来得到了广泛应用，目前已经开发出了针对各种病原体的免疫磁珠。免疫磁珠分离技术(IMBS)特点是不但减少检测耗时，而且可提高检测限。

3　基因检测

由于病原微生物的核酸序列具有特异性，因此鉴别病原微生物可能过检测其特有的基因片段序列来实现。

3.1核酸杂交技术

核酸原位杂交和膜上印迹杂交两种技术主要应用在病原微生物检测中。其中核酸原位杂交是直接与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，而膜上印迹杂交是标记的核酸探针与从微生物细胞中分离出来的核酸进行杂交，与其他方法比，核酸杂交种技术除了更加简便快速外，在特异性和敏感性上也都较为突出。

3.2基因芯片技术

通过对上述核酸分子杂交技术发展和延伸，在微生物检测领域更应用了基因芯片(DNA chip)技术，该技术是通过微加工技术，将数以万计甚至百万计的基因探针有规律地排列成二维DNA探针阵列，固定后与标记的样品分子进行核酸杂交，用于基因检测工作。基因芯片技术的特点是除了缩短了确诊所需要的时间外，还能检测出病原体耐药的情况。但基因芯片技术同样还有些问题有待解决，如提高芯片的特异性和检测信号的敏感性，降低芯片的制作成本等，而且多数芯片都需要昂贵的检测仪器，这些问题使得基因芯片到目前主要局限于实验室研究而未能广泛应用于临床病原微生物的检测与鉴定[1]。

3.3聚合酶链反应技术

作为一种DNA的体外扩增技术，聚合酶链反应技术是用已知寡核苷酸引物引导未知片段中微量待测基因片段并进行扩增的技术。利用PCR可以对待测基因进行扩增的特性对病原体感染进行早期诊断，是特别适用的。如果特异性不强，可能会造成假阳性的出现，虽是如此，PCR技术仍然发展迅速，通过对PCR技术进行改进，使之派生出许多新用途，从而使PCR技术得到了进一步的完善。其中多重PCR、实时荧光定量PCR受到广泛关注。

3.3.1多重PCR技术

多重PCR技术大量样本的分析与鉴定适合采用此方法。目前采用基因芯片技术与多重PCR相结合的技术也大量应用于实际工作中。由于通过PCR对目的基因进行放大结合基因芯片的荧光探针增加检测的灵敏性和特异性，如此达到两种检测技术优势的充分发挥[2]。

3.3.2实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR原理是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个进程，其特点是灵敏高、特异性强，同时能够有效地解决PCR污染问题。荧光基团标记的特异性引物能够反映病原体感染和药物疗效，大多应用于不可人工培养或难以培养的病原体感染的诊断。

4　未来展望

从应用角度出发，无论是临床诊疗还是疾病预防，快速准确地对病原体进行检测和鉴定都有着十分重要的意义。当前生物学研究已由宏观领域向微观领域的迅速发展，病原体检测方法也随之延伸到分子水平和基因水平[3]。病原微生物高通量检测技术的快速推进，无疑是适应未平发展需求的结果，由于这些技术具有方便快速、结果精确、无污染及自动化程度高等优点，因此在未来的应用中，高通量诊断技术在病原微生物的诊断分析方面起到的作用将会越来越重要。

[1] 蔡挺,李巧云，张顺，等. 基因芯片技术检测常见革兰阴性杆菌耐药基因的研究[J]. 中华医院感染学杂志，2011，21(21)：4111-4112.

[2] 王晓宏，熊正英. 多重PCR-质谱联用技术在病原体检测中的应用及比较[J]. 微生物学免疫学进展，2011，39(4)：81-83.

[3] 贺晨，孙鸿燕，邵丽筠，等. 多重PCR结合基因芯片技术检测11种致病菌方法的建立[J]. 中国实验诊断学，2011，15(4)：587-591.

Progress Pathogen Detection Technology

ZHANG Yanqiu, Mulan County Disease Control and prevention Center, Haerbin 151900, China

Rapid identification of pathogenic microorganisms upgrading inspection techniques very quickly, mainly due to microbial physiological characteristics, the variety and variability of their rapidly. Pathogens rapid and accurate detection is essential. Conventional detection methods complex operation, time-consuming, and extremely high demands on the operator, has been far from satisfying a variety of pathogens present diagnostic and epidemiological studies, rapid microbial detection technology must be developed in order to adapt to the future development of Claim.

Microorganism, Detection technology, Progress

R446.5

B

1674-9308（2015）09-0175-02

10.3969/j.issn.1674-9308.2015.09.151

151900 哈尔滨市木兰县疾病预防控制中心