壮筋续骨汤对骨折大鼠血清内源性生长因子水平的影响及意义

周 缜，蓝 青，李洪波，宁 驰

壮筋续骨汤对骨折大鼠血清内源性生长因子水平的影响及意义

周 缜1，蓝 青1，李洪波2，宁 驰1

目的：研究壮筋续骨汤对股骨骨折后大鼠血清中骨形态发生蛋白（BMP7）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、碱性成纤维细胞因子（bFGF）和转化生长因子β1（TGFβ1）水平的影响，探讨其促进骨折愈合的机制。方法：成年健康雄性Wistar大鼠72只，随机数字表法分为假手术组、对照组、治疗组各24只。用低速牙科钻在股骨中段切断股骨制备骨折模型，应用壮筋续骨汤水煎液干预治疗7 d、14 d、21 d、28 d后取材观察，X线摄片观察骨折局部愈合情况，苏木精-伊红染色观察骨痂组织病理变化，酶联免疫吸附试验检测血清BMP-7、IGF-1、bFGF和TGFβ1水平。结果：骨折7 d骨折断端被纤维性组织填充；14 d纤维性骨痂开始形成，成骨细胞增多；至21 d有钙盐沉着，破骨细胞、成骨细胞活跃；至28 d骨性骨痂形成，大量骨小梁形成。治疗组大鼠骨折后7～21 d骨痂结构变化与对照组相应时间点比较无明显差异，但至28 d治疗组骨痂结构优于对照组，其皮质骨及髓腔可辨，成像更加清晰。血清BMP-7、IGF-1、bFGF和TGFβ1水平在骨折后7 d、14 d、21 d、28 d对照组和治疗组明显高于假手术组(t=20.46～21.07，P＜0.05)，在第28 d,治疗组明显高于对照组(t=12.92，P＜0.05)和假手术组(t=8.63，P＜0.05)。结论：壮筋续骨汤可能通过抑制内源性BMP7、IGF-1、bFGF和TGFβ1降解，增强其活性，发挥促进骨折愈合的作用。

壮筋续骨汤；大鼠；骨折；内源性生长因子

骨折创伤后，机体细胞生物因子发生应激性改变，骨折端坏死骨细胞、成骨细胞以及被吸收的骨基质均向周围释放内源性生长因子,其中骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein-7，BMP-7）和胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）、碱性成纤维细胞因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、转化生长因子β1（transforming growth factor，TGFβ1）的作用尤为突出。有研究表明，大鼠股骨骨折后应用壮筋续骨汤干预治疗，具有促进骨折愈合的作用[1-2]，但观察时间只有2周，未能全面反映骨折愈合的过程[3]。本实验试图观察壮筋续骨汤对大鼠股骨骨折后血清BMP-7、IGF-1、bFGF和TGFβ 1水平影响，探讨其促进骨折愈合的作用机制。

1 材料和方法

1.1 动物模型 成年健康雄性Wistar大鼠72只，体质量230～250 g，清洁级，青岛市药物检验所动物中心提供，许可证号SCXK（鲁）20120010。适应性饲养7 d，应用随机数字表法分为假手术组、对照组、治疗组各24只。10%水合氯醛腹腔注射麻醉动物（300 mg/kg），俯卧位固定，常规消毒右下肢股骨段，取股外侧切口，经股前、外侧肌间隔分离暴露股骨，在股骨中段（大转子下1 cm）用低速牙科钻（JBX-NE22，NSK Co.Ltd.Japan）切断股骨，行克氏针（直径1 mm，上海医用缝合针厂）髓腔逆行固定股骨（假手术组动物不切断股骨），逐层缝合切口，常规消毒，拍摄骨折股骨X线片。手术后将大鼠放置笼中，每笼1只，单独饲养，成活率100%。

1.2 治疗方法 壮筋续骨汤配方：当归12 g，川芎12 g，熟地10 g，三七10 g，黄芪12 g，杜仲12 g，川续断12 g，骨碎补12 g，红花10 g，白芍10 g。由日照中医院中药制剂室严格依据《医疗机构中药煎药室管理规范》[国中医药发（2009）3号]要求制备：室温20～25℃,相对湿度≤85%条件下，用符合国家卫生标准的常温自来水浸泡药材约20～30 min,煎制时先武火后文火，保持微沸状态10～15 min,使有效药物成分充分溶解。每副中药要煎煮两次，药材充分煎透，达到无糊状块、无白心、无硬心，最终药液250 mL，含生药125 g，浓度0.5 g/m，用符合国家标准药品包装材料分装药液，室温冷却，-20℃储存。给予治疗组大鼠每日1.25 g/kg（2.5 mL/kg）定量口服喂养，1次/d，连续28 d。对照组和假手术组同步给予等量的生理盐水。

1.3 评价指标 分别于治疗7、14、21、28 d后，每组各取6只动物观察。

1.3.1 X线摄片 10%水合氯醛腹腔注射（300 mg/kg）麻醉大鼠，X线摄片（GE Revolution RE/d型，USA）观察骨痂结构和骨质密度改变，判断骨折愈合情况。

1.3.2 大体观察 10%水合氯醛腹腔注射（300 mg/kg）麻醉大鼠，完整取出股骨，剔除多余软组织，生理盐水洗涤，照相记录骨折愈合情况。

1.3.3 组织病理 将股骨置4%多聚甲醛中固定24 h，蒸馏水浸泡4 h，置于20%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液脱钙15 d。截取骨折处上、下各0.5 cm之间的组织（包括血肿、骨痂组织），常规乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，应用切片机（Leica2015,上海）沿纵轴切片，厚5μm，贴于载玻片。苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察骨痂的组织结构。

1.3.4 酶联免疫吸附试验 麻醉大鼠，经腹主动脉取血（4 mL），普通离心机4000 r/min离心10 min，分离血清（2 mL）。采用双抗夹心ELISA试剂盒（Blue Green公司）测定大鼠血清BMP-7、IGF-1、bFGF、TGFβ1水平。按试剂盒说明书操作，向特异性抗体包被酶标板中每孔加血清标本100μL，37℃孵育2 h，双蒸水洗涤5 min×3次，加显色剂显色2 min，双蒸水洗涤5 min×3次，洗板机拍干，用酶标仪（Bio-Rad 550型，美国）在450 nm测定每孔的吸光度值，根据样品的吸光度值在制备标准曲线坐标上找出对应的BMP-7（pg/mL）、IGF-1（ng/L）、bFGF（ng/L）和TGFβ1（ng/L）浓度。

2 结果

2.1 X线观察 假手术组大鼠股骨骨皮质完整、连续（图1A），模型组（对照组、治疗组）大鼠骨折当天骨折线清晰，骨皮质连续性中断（图1F）。对照组大鼠骨折7 d（图1B）骨折断端被纤维性组织填充，但骨折线仍然明显，至14 d（图1C）纤维性骨痂开始形成，至21 d（图1D）有钙盐沉着，至28 d（图1E）骨性骨痂形成，骨小梁排列不规则。治疗组大鼠骨折后7～21 d（图1G、H、I），骨痂结构变化与对照组相应时间比较无明显差异，但至28 d治疗组骨痂结构（图1J）优于对照组（图1E），其皮质骨及髓腔可辨，成像更加清晰。

图1 大鼠骨折愈合的X线观察

2.2 大体观察 假手术组大鼠骨皮质完整（图2A），模型组大鼠骨折线清晰（图2F）。对照组骨折7 d（图2B）骨折断端被纤维性肉芽组织包围（针扎易透），14 d（图2C）纤维性骨痂形成、变硬（针扎有阻力），21 d（图2D）纤维性骨痂和软骨骨痂增多、中心硬度增大（针扎阻力增大），28 d（图2E）纤维性骨痂逐渐被软骨和骨性骨痂代替，硬度增大（针扎不透）。治疗组大鼠术后7～21 d（图2G、H、I）骨痂结构与对照组相应时间点比较无明显差异，但至28 d治疗组骨痂（图2J）硬度较对照组（图2E）明显增大（针扎不进）。

2.3 组织病理 假手术组大鼠骨质结构正常（图3A），模型组大鼠在骨折当天骨折端断为血肿组织所填充（图3F）。对照组骨折后7 d（图3B）形成肉芽组织，14 d（图3C）骨折端纤维性组织、成骨细胞增多，形成大量纤维性骨痂，21 d（图3D）破骨细胞、成骨细胞活跃，骨小梁形成，28 d（图3E）骨小梁清晰可见。治疗组骨痂结构在7～21 d（图3G、H、I）与对照组相应时间比较无显著性差异，但至28 d（图3J）骨痂结构显著优于骨折组（图3E）。

2.4 酶联免疫检测 假手术组血清BMP-7水平在术后7～28 d未见显著性变化（t=0.54～1.03，P＞0.05）；对照组和治疗组在术后7～28 d各时间点均显著高于假手术组（t=20.46～21.07，P＜0.05）；治疗组术后7～21 d与对照组相应时间点比较无显著性差异（t=0.64～0.93，P＞0.05）；疗组术后28 d显著高于对照组（t=12.92，P＜0.05）和假手术组（t=8.63，P＜0.05）。见表l。

图2 大鼠骨折标本的大体线观察

图3 大鼠骨折处骨痂的病理学观察，HE染色×200

表1 各组大鼠各时间点血清BMP-7水平（±SD，pg/mL）

表1 各组大鼠各时间点血清BMP-7水平（±SD，pg/mL）

注：与假手术组比较,aP＜0.05;与对照组比较,bP＜0.05;与21 d比较,cP＜0.05

组别假手术组对照组治疗组n6 6 6 7 d 428.24±11.15 538.85±12.17a 530.69±14.36a 14 d 430.94±11.26 540.42±12.22a 534.70±13.55a 21 d 433.14±10.65 543.14±13.28a 536.42±13.32a 28 d 432.83±10.53 450.69±11.65a、c 493.27±10.59a、b、c

假手术组血清IGF-1水平在术后7～28 d未见显著性变化（t=0.54～1.03，P＞0.05）；对照组和治疗组在术后7～28 d各时间点均显著高于假手术组（t=20.46～21.07，P＜0.05）；治疗组术后7～21 d与对照组相应时间点比较无显著性差异（t=0.64～0.93，P＞0.05）；治疗组术后28 d显著高于对照组（t=12.92，P＜0.05）和假手术组（t=8.63，P＜0.05）。见表2。

假手术组血清bFGF水平在术后7～28 d未见显著性变化（t=0.54～1.03，P＞0.05）；对照组和治疗组在术后7～28 d各时间点均显著高于对照组（t=20.46～21.07，P＜0.05）；治疗组术后7～21 d与对照组相应时间点比较无显著性差异（t=0.64～0.93，P＞0.05）；治疗组术后28 d显著高于对照组（t=12.92，P＜0.05）和假手术组（t=8.63，P＜0.05）。见表3。

表2 各组大鼠各时间点血清IGF-1水平（±SD，pg/mL）

表2 各组大鼠各时间点血清IGF-1水平（±SD，pg/mL）

注：与假手术组比较,aP＜0.05;与对照组比较,bP＜0.05;与21 d比较,cP＜0.05

组别假手术组对照组治疗组n 6 6 6 7 d 17.35±0.71 21.08±1.07a 20.35±0.95a 14 d 17.43±0.65 21.22±1.13a 20.39±0.97a 21 d 17.62±0.70 20.47±0.96a 21.25±0.92a 28 d 17.71±0.65 18.02±0.83a、c 20.25±0.85a、b、c

表3 各组大鼠各时间点血清bFGF含量（±SD，ng/L）

表3 各组大鼠各时间点血清bFGF含量（±SD，ng/L）

注：与假手术组比较,aP＜0.05;与对照组比较,bP＜0.05;与21 d比较,cP＜0.05

组别假手术组对照组治疗组n6 6 6 7 d 18.36±0.74 22.54±0.82a 22.63±0.77a 14 d 18.23±0.89 22.61±0.86a 22.76±0.75a 21 d 17.89±0.87 23.24±0.94a 23.22±0.88a 28 d 18.07±0.73 18.16±0.56a、c 21.23±0.64a、b、c

假手术组血清TGFβ1水平在术后7～28 d未见显著性变化（t=0.54～1.03，P＞0.05）；对照组和治疗组在术后7～28 d各时间点均显著高于对照组（t=20.46～21.07，P＜0.05）；治疗组术后7～21 d与对照组相应时间点比较无显著性差异（t=0.64～0.93，P＞0.05）；疗组术后28 d显著高于对照组（t=12.92，P＜0.05）和假手术组（t=8.63，P＜0.05）。见表4。

表4 各组大鼠各时间点血清TGFβ1含量（±SD，ng/L）

表4 各组大鼠各时间点血清TGFβ1含量（±SD，ng/L）

注：与假手术组比较,aP＜0.05;与对照组比较,bP＜0.05;与21 d比较,cP＜0.05

组别假手术组对照组治疗组n6 6 6 7 d 122.01±8.14 162.55±10.19a 154.52±13.93a 14 d 124.96±7.54 161.08±12.26a 157.69±10.86a 21 d 123.61±8.42 163.09±11.21a 160.04±12.44a 28 d 124.66±7.01 127.28±7.43a、c 149.29±8.15a、b、c

3 讨论

骨折是骨的完整性和连续性中断。依据组织、细胞学的变化，将骨折愈合分为血肿机化期、原始骨痂形成期、骨痂改造塑型期三个阶段。在血肿机化期，丹参、川芎、红花等活血化瘀药物可以改善骨折断端局部血液循环，为骨痂形成提供物质保障。在骨痂形成期，续断、骨碎补等含有丰富胶原、钙盐和微量元素，参与蛋白合成酶代谢等，有利于骨质修复[4]。黄佩军[1]应用壮筋续骨汤联合锁定加压钢板内固定治疗胫骨平台骨折有效率达90%；张学恒等[5]应用单侧多功能外固定支架配合壮筋续骨汤治疗肱骨骨折骨不连，骨折愈合率高达97.4%。

骨折愈合是一个复杂的骨再生、修复过程，有多种细胞因子参与。随着基因、生物技术的不断提高，对骨生长因子促进骨折愈合机制的认识也不断深入[6]。Urist等[7]首先发现了BMP，并由此提出了“诱导成骨”理论。BMP-7具有强烈的诱骨活性，其通过干预间充质干细胞内转录因子Runx2和Osterix的表达，诱导间充质干细胞向成骨细胞分化，并协同其他调节因子参与骨组织的形成[8]。IGF-1是调节骨细胞功能和代谢的重要因子，能减少骨胶原退化、增加骨质沉积，促进成骨细胞分化、成熟及补充[9]，并以剂量-时间依赖性方式影响其增生及功能代谢[10]。IGF-1与骨组织中的受体结合，发生受体自身磷酸化激活络氨酸蛋白酶,促使胰岛素受体底物磷酸化，从而调节软骨细胞、骨细胞的生长、增殖与代谢[11-13]。

bFGF通过调节细胞增殖、分化并改变细胞产物的合成而作用于成骨过程，不仅促进骨细胞的生长，而且促进毛细血管的增生，改善血液供应，促进成骨细胞与支架材料的黏附[14]。在参与骨折修复过程中，TGF-β1与bFGF有正协同作用，TGF-β1是bFGF的调控因子[15]。联合应用能协同刺激成骨细胞增殖，加速软骨内骨化的进程,比单独应用一种因子具有更明显的成骨诱导作用[16-18]。内源性bFGF在骨折愈合各阶段有恒定的基因表达水平，一般是骨损伤初期表达强烈，到高峰后表达逐渐减弱：在骨折后l～3周内持续存在于骨折位点，从第4 d至3周内，bFGF表达强烈，随时间的推移逐渐减弱[19]。bFGF早期表达能使骨端多种细胞分裂、增殖，使血肿机化形成肉芽组织，后期主要使间质细胞或成纤维细胞保持增殖活跃状态。

骨生长因子生物活性大，生理作用强，能加速骨折愈合，但是外源性细胞因子半衰期短，清除率高，不能持续有效地促进骨折愈合。中药治疗骨折，除了解痉止痛、活血化瘀、去腐生肌等常规作用外，也直接或间接影响骨生长因子的分泌、降解和活性调节。实验研究显示，中药治疗骨折可通过提高外骨痂、联接骨痂、桥梁骨痂、矿化骨痂的体积密度，从而增加骨骼强度，使骨痴拉伸强度、弯曲强度、抗折力、载荷量等力学性能明显增强。王力等[20]实验结果显示，用壮筋续骨汤体外培养骨细胞，S期细胞明显增多，能促进成骨细胞增殖。说明壮筋续骨汤能促进成骨细胞DNA的合成，通过促进成骨细胞增殖来实现加快骨折愈合的作用。王祥杰等[21]动物实验表明，壮筋续骨汤在骨折初期即能显著提高实验性大鼠血清BMP-7、NPY水平，促进实验性大鼠骨折愈合。

本次实验结果显示，壮筋续骨汤在骨折术后第1～3周内并没有提高大鼠血清中BMP7、IGF-1、bFGF和TGF-β1水平，只是在21 d后，能使骨生长因子继续保持较高水平，说明壮筋续骨汤并不能促进内源性骨生长因子分泌，可能只是在骨折愈合后期起到减缓内源性BMP7、IGF-1、bFGF和TGFβ1降解、延长其半衰期、增强其活性，从而发挥促进骨折愈合的作用。

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The Effect of Zhuangjin Xugu Decoction on Serum Levels of Endogenous Growth Factor in Femur Frac⁃ ture Rats

ZHOU Zhen,LAN Qing,LI Hong-bo,et al.Institute of Integrative Medicine,Qingdao University,Qingdao(266021),China

ObjectiveTo investigate the effects of Zhuang Jin Xu Gu Decoction(“ZJXG Decoction”)-which literally means a decoction for strengthening tendons and bones-on serum levels of bone morphogenetic pro⁃tein-7(BMP-7)and insulin-like growth factor-1(IGF-1),basic fibroblast growth factor(bFGF)and transform⁃ing growth factor β1(TGFβ1).MethodsSeventy-two male adult Wistar rats were randomly divided into sham-operated group,control group and treatment group,with 24 rats in each group.Femur fractures were gener⁃ated by cutting femur transversely at middle point.ZJXG Decoction was orally administered after sur⁃gery for 7～28 days,and fracture healing observed by X-ray,the pathological changes of the callus ob⁃served by collecting samples for hematoxylin-eosin staining.The serum levels of BMP-7 and IGF-1,bFGF and TGFβ1 were detected by enzyme-linked immunobsorbent assay(ELISA).ResultsSeven days after fracture,the fracture gap was fully filled by fibrous tissue;in 14 days,fibrous callus formatted,osteoblasts increased;in 21 days,calcium salt deposited,osteoclast formed and osteoblast activity increased;in 28 days,bony callus formed,a large amount of trabecular bone formatted.The callus of treatment group rats showed no significant dif⁃ference from that of the control group at the corresponding time points from 7 to 21 days after fracture,but in 28 days,the treatment group showed better callus than control group did,and the cortical bone and medullary cavi⁃ty could be identified with more clear image.ELISAResultsshowed that the serum levels of BMP-7,IGF-1,bF⁃GF and TGFβ1 in the control group and the treatment group from 7 day to 28 days were significantly higher than those in the sham-operated group(t=20.46～21.07,P＜0.05);in 28 days,the levels in the treatment group became significantly higher than those in the control group(t=12.92,P＜0.05)and sham-operated group(t=8.63,P＜0.05).ConclusionIt can be concluded that ZJXG Decoction could enhance the fracture healing by reducing the decomposition of BMP-7 and IGF-1,bFGF and TGFβ1 and enhancing their activities.

Zhuangjin Xugu decoction;rats;fracture;endogenous growth factors

Q95-33;R683

A

1007-6948(2015)05-0479-06

10.3969/j.issn.1007-6948.2015.05.012

1.青岛大学医学院中西医结合研究中心（青岛 266021）

2.青岛大学医学院松山医院（青岛 266021）

周缜，E-mail：lnlyfly@163.com

（收稿：2014-06-08 修回：2015-08-20）

（责任编辑 李秀兰）