生活污泥与秸秆混合发酵微生物菌株的筛选及拮抗关系研究

吴金男杨浩深 梁剑光宋廷鸿 马国胜 尹凡梁先龙 季群

（1常熟理工学院生物与食品工程学院 江苏常熟 2155002苏州荣基生态生物科技有限公司 江苏吴江 215222）

污泥是一种可利用的有机固体废物，尤其是一种可再生的生物资源。由于污泥中含有大量促进植物生长的有机物质和丰富的氮磷钾等营养成分以及多种微量元素，因此是重要的有机肥资源和良好的土壤改良剂。污泥堆肥施入土壤后可增加土壤的保水和透气性，提高土壤的排水能力。但是，我国污泥处置的现状仍然相当严峻，将近90%的生活污泥没有得到很好的处理，由此造成的污染与二次污染问题也不容忽视[1]。污泥堆制发酵是一种很好的生物处理方式。在微生物的作用下，污泥的臭味可以大大降低并消除其中的有害物质，可以作为土壤的有机肥料或者土壤改良剂，实现废弃物的无害化和资源化[2-4]。本研究通过对秸秆粉和生活污泥混合堆肥的方法，筛选出有利于污泥堆肥处理的微生物。通过研究他们之间的拮抗关系，为以后采用人工接种的方法进行混合菌群堆肥发酵、实现污泥的无害化处理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

生活污泥、秸秆粉，由苏州荣基生态生物科技有限公司提供。

1.2 培养基

1.2.1 菌株分离及拮抗试验培养基

牛肉膏 3.0g，蛋白胨 10.0g，NaCl 5.0g，琼脂 15～25g，水1000mL，pH 7.4～7.6。

1.2.2 生理生化试验培养基

耐盐性试验培养基：采用牛肉膏蛋白胨液体培养基改变NaCl浓度分别为5%、7.5%、10%、15%。

淀粉水解试验培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中添加0.2%的可溶性淀粉，按倒平板的要求分装。

休和利夫森二氏培养基：蛋白胨 2g，NaCl 5g，K2HPO40.2g，葡萄糖10g，蒸馏水1000mL，1%溴麝香草酚蓝水溶液3mL，pH7.0～7.4。

乙酰甲基甲醇试验培养基：肉汁胨培养液100mL，KNO3lg，pH7.0～7.6。

明胶水解培养基：蛋白胨5g，明胶100～150g，水1000mL，pH 7.2～7.4。

吲哚试验培养基：蛋白胨 10g，NaCl5g，水 100mL，pH7.2～7.4。

硝酸盐还原试验培养基：KNO30.1g，蛋白胨2.5g，蒸馏水500mL，pH7.4。

1.3 方法

1.3.1 堆肥方法

采用静态通风发酵法堆肥。发酵容器规格为50cm×50cm×100cm。箱体分覆盖层、物料层、垫料层、接液层四层，由隔离网隔离，接液层有通风气孔。物料按照秸秆与污泥质量比1:1的比例混合均匀并添加适量麸皮。初始堆料含水率在60%左右，自然发酵至腐熟。

1.3.2 发酵料中细菌的分离纯化

取发酵料，用无菌生理盐水制成悬浮液，悬浮液振荡30min后静置5分钟。取上清液，采用平板划线法分离菌种，37℃培养48h后挑菌分离并进行3次纯化。

1.3.3 菌株初步鉴定

参照相关文献方法[5-6]，通过菌落的形态、个体形态、生理生化特征等项目的试验结果进行初步鉴定。

1.3.4 拮抗实验

采用平板对峙培养法。在保证菌落之间能相遇的距离内，于平板上同时点接不同种微生物菌株，一定条件下培养一段时间后，观察菌落之间有无拮抗。

2 结果与分析

2.1 结果

2.1.1 菌株分离

发酵15天后，堆肥已腐熟稳定。堆肥表观指标：堆料呈深棕褐色松散状，无臭，含水率在40%以下。从发酵料中分离筛选到九个菌株，分别编号为菌株Z1-Z9。

2.1.2 分离菌株的形态

从菌落形态看，Z-1以及Z6～Z9菌株菌落干燥，不透明，表面有褶皱凸起，边缘呈锯齿状，淡黄色。Z-2～Z4菌株菌落较湿润，不透明，表面光滑平整，边缘圆整，白色。从革兰氏染色及镜检结果看，9个菌株均为革兰氏阳性细菌。其中，Z-1、Z-6、Z-7、Z-8、Z-9个体形态比较相似，呈短链状排列，有芽孢，芽孢中生或近中生。Z-2菌杆状比其他菌稍长，有芽孢，呈长链状排列。Z-3、Z-4、Z-5呈短杆状，芽孢中生或近中生。

2.1.3 分离菌株的生理生化特征

耐盐性试验表明，9个菌株在5%和7.5%NaCl培养基中均生长良好；当盐浓度达到10%以上时，Z-1、Z6和Z-8能生长，其它菌生长不良。

耐温性试验表明，，50℃下9种菌都能很好的生长；60℃时，Z-1、Z6和Z-8能生长，其它菌生长不良。

根据个体形态、菌落特征、革兰氏染色结果和生理生化特征，初步鉴定，Z-1、Z-6和Z-8为地衣芽孢杆菌，Z-7和Z-9为蜡状芽孢杆菌，Z-2为类芽孢杆菌属细菌、Z-3、Z-4和Z-5三个菌株为芽孢杆菌属的细菌。

2.2 拮抗试验结果

拮抗是微生物在其生长过程中所产生的代谢产物对周围环境其它微生物所产生的抑制作用，若微生物之间存在拮抗关系，则必须消除其拮抗作用后才能混合培养。

拮抗试验表明，Z-1、Z-6、Z-7、Z-8、Z-9细菌完全互不拮抗，Z-2、Z-3、Z-4、Z-5菌也完全互不拮抗；而上述两组细菌之间拮抗关系不明显，基本无拮抗。

2.3 分析讨论

结合菌落形态、个体形态、革兰氏染色和生理生化试验结果，参照《常见细菌系统鉴定手册》和《一般细菌常用鉴定方法》，可初步鉴定出9个菌株均为芽孢杆菌，分属芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属。拮抗试验表明，9个菌株之间基本没有拮抗关系。本试验为下一步通过这些菌的混合培养制作混合微生物菌剂作为生活污泥与秸秆发酵的发酵剂为提供了依据。

[1]张辰.污水处理厂污泥处理处置技术政策解读与污泥产业“十二五”展望[J].水工业市场,2010(4）:23-27.

[2]李国学,张福锁．固体废物堆肥化与有机复合肥生产[M].北京：化学工业出版社,2000．