念珠菌耐药机制的研究进展

贺小圆 赵明峰

（天津医科大学一中心临床学院天津市第一中心医院血液科，天津300192）

念珠菌耐药机制的研究进展

贺小圆 赵明峰

（天津医科大学一中心临床学院天津市第一中心医院血液科，天津300192）

近年来，真菌感染尤其是机会性真菌感染的发生率和病死率呈不断上升的趋势，这主要与真菌耐药和抗真菌药物品种有限有关。念珠菌是人体内的重要条件致病真菌，其常见的耐药机制包括靶酶的改变、靶位的缺乏、真菌细胞膜对药物的通透性下降、多药耐药蛋白表达增高、固醇合成旁路下游的改变、生物膜的形成等，最新文献报道分泌型天冬氨酸蛋白酶在念珠菌的耐药形成中存在一定作用。该文就念珠菌感染的流行病学和念珠菌的耐药机制两个方面进行综述。

念珠菌；真菌耐药；耐药机制；分泌型天冬氨酸蛋白酶

［Chin J Mycol，2015，10（1）：49⁃53］

真菌耐药是描述真菌感染对抗真菌治疗反应不佳，以至抗真菌药物对真菌感染的治疗失败。近年来，由于抗真菌药物品种和临床使用量的增多，以及药物的选择性压力，致使耐药真菌数量及种类迅速增加，不仅影响药物的治疗效果，而且呈现出交叉耐药，尤其威胁免疫功能受损的患者，如艾滋病、血液病或者接受器官移植的患者。深入研究真菌的耐药机制，减缓与克服其耐药性的发展，成为国内外研究的热点。现就念珠菌感染的流行病学和念珠菌的耐药机制两个方面进行综述。

1 念珠菌感染的流行病学

近30 a来，真菌感染尤其是机会性真菌感染的发生率和病死率呈不断上升的趋势。其中，真菌血症增多尤为明显，导致住院时间延长和死亡率增高［1］。这主要与真菌耐药和抗真菌药品种有限有关［1］。念珠菌是人体内的重要条件致病真菌，主要定植于皮肤和黏膜，如口腔、胃肠道、阴道等处，正常情况下不致病。当机体免疫力下降时，如抗菌药物、免疫抑制剂、糖皮质激素等药物的广泛应用，白细胞减少、肿瘤、HIV感染、糖尿病等疾病的发病率增加，体内留置导管、吻合物、人工瓣膜等侵入性操作的大量使用，器官移植的大型开展，老年患者的增多［2⁃3］，可导致浅表性念珠菌病，甚至侵袭性念珠菌病。

目前，人类已发现至少有17种念珠菌可致机体感染，其中超过90%的念珠菌感染是由白念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌和克柔念珠菌引起［4］。念珠菌病最常见的病原体是白念珠菌。近年来，非白念珠菌如光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌的发病率也明显增高［5］。据文献报道，非白念珠菌病占所有念珠菌病的35%～65%［2］。Tortorano等［6］对欧洲的念珠菌血症进行了分析，发现50%以上是由白念珠菌引起，光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌分别占14%、14%、7%。一项在北美洲23个医疗中心开展的涉及2 019例患者念珠菌血症的样本研究结果显示，白念珠菌分离株占45.6%，而非白念珠菌占54.4%［7］。Cornistein等［8］对阿根廷的神经学中心2006～2010年间的念珠菌流行病学进行研究，观察到白念珠菌占所有临床样本的43.3%，而非白念珠菌占56.7%。可见，白念珠菌是最常见的致病性念珠菌，且非白念珠菌发病率也在不断增高。

2 念珠菌的耐药机制

目前，临床用于治疗念珠菌病的抗真菌药物有唑类、多烯类、棘白菌素类、5⁃氟胞嘧啶等。研究表明，念珠菌对这些药物均存在不同程度的耐药现象，但各种药物的耐药机制有所不同。常见的耐药机制包括靶酶的改变、靶位的缺乏、真菌细胞膜对药物的通透性下降、多药耐药蛋白（MDR）表达增高、固醇合成旁路下游的改变、生物膜的形成等。目前有关念珠菌耐药机制的研究已经取得了重要进展，最新文献报道分泌型天冬氨酸蛋白酶（Sap）在念珠菌的耐药形成中存在一定作用。以下将对念珠菌这些可能的耐药机制进行详述。

2.1 靶酶的改变与念珠菌耐药

抗真菌药物通过与相应的靶酶结合，发挥抗真菌作用，如唑类、棘白菌素类。当靶酶发生改变后，抗真菌药物无法与其进行有效的结合而产生真菌耐药。以唑类为例，唑类靶酶是一种细胞色素P450氧化酶，即羊毛甾醇 14α⁃去甲基化酶（CYP51、ERG11基因编码），药物与靶酶结合，影响羊毛甾醇14α⁃甲基的羟基化反应从而造成麦角甾醇合成减少以及一些甾醇前体化合物的增多。此外，羊毛固醇在14⁃还原酶的催化下生成无毒的14α⁃甲基粪固醇，后者在 Δ5，6⁃甾醇去饱和酶（ERG3编码）作用下转变毒性甾醇14α⁃甲基⁃3，6⁃二醇，缺乏麦角固醇和14α⁃甲基⁃3，6⁃二醇的堆积抑制了真菌的生长。当靶酶CYP51发生突变或过量表达时，均可能产生真菌耐药［3］。①靶酶CYP51过量表达，导致胞内药物相对不足，不能完全抑制靶酶活性，从而对唑类药物耐药。②靶酶CYP51基因突变导致了唑类药物对其亲和力降低。从临床耐药菌株发现的CYP51氨基酸变异和通过定点突变技术研究表明，Y132H变异能使CYP51对氟康唑和伊曲康唑的亲和力分别下降1／4和1／2。类似的突变位点还有T315A、A149V、D153E、E165Y、S279F、G465S、R467K、S405F等。多位点组合变异能使亲和力下降更明显，如Y132H和S405F组合、Y132H和R467K组合。

此外，棘白菌素类药物也是通过作用于靶酶发挥抗真菌作用。其作用机制是该类药物与靶酶β⁃（1，3）⁃D⁃葡聚糖合酶 （GS）结合，干扰真菌细胞壁β⁃1，3⁃D⁃葡聚糖的合成，后者是真菌细胞壁的重要组成部分，维持着细胞壁刚性和完整性，葡聚糖合成受阻后导致真菌细胞渗透压不稳定，最终引起细胞溶解。哺乳动物细胞因缺乏细胞壁而不受其影响。棘白菌素类是一类新型抗真菌抗生素，主要包括卡泊芬净、米卡芬净、阿尼芬净。其应用时间相对较短，但近来美国和欧洲国家已经报道了白念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌的耐药案例。GS含2个亚基：催化亚基（FKS1和FKS2编码）和调节亚基 （Rho1p）［9］。目前认为，棘白菌素类耐药主要和FKS基因突变有关。白念珠菌、热带念珠菌和克柔念珠菌突变主要发生在FKS1，而光滑念珠菌可发生FKS1和FKS2突变［10］。FKS1基因是 GS的主要催化亚基，当FKS1发生突变，其对棘白菌素类抗真菌药物的耐受性提高 （高于敏感菌株的10倍以上），对临床分离的耐白念珠菌菌株的检测发现，FKS1的突变主要集中在其HS区域，其相应的氨基酸区域 在 641⁃649位 （HS1）和 1357⁃1364位（HS2），其中Ser645发生突变的频率最高。Gar⁃cia⁃Effron等报道，光滑念珠菌Fks1p中632位的天冬氨酸置换成谷氨酸，和Fks2p中659位的苯丙氨酸置换成缬氨酸可导致棘白菌素类耐药［11］。

2.2 靶位的缺乏与念珠菌耐药

某些抗真菌药物通过与真菌细胞相应的靶位结合，产生抗真菌作用。当靶位缺乏时，可导致真菌耐药。此类耐药机制以多烯类药物为代表。

多烯类抗真菌药物主要包括两性霉素B（AmB）、制霉菌素。其特点是作用于细胞膜中含有固醇的真菌，多烯类抗真菌药物通过其疏水的双键与固醇结合形成甾醇一多烯复合物，使细胞膜脂质层发生去极化，形成多孔状，使K＋、Mg2＋等离子和基质外泄而导致真菌死亡。此外还可通过氧化反应进一步加重细胞膜氧化损伤从而导致细胞死亡。AmB已在临床使用多年，有欧洲研究报道，大多数念珠菌对AmB敏感，然而少数念珠菌仍然对其存在耐药现象。对耐药株细胞膜进行分析，发现耐AmB的念珠菌细胞膜中的麦角甾醇含量较敏感株减少［12］。有研究认为，使用唑类抗真菌药物抑制麦角甾醇的生物合成，能致细胞膜中缺少AmB的结合位点，使真菌对AmB产生耐药性。

2.3 细胞膜通透性下降与念珠菌耐药

细胞膜的主要成分包括蛋白质、糖类、磷脂和固醇等。细胞膜成分的改变可导致药物的膜通透性降低，使得细胞摄取和蓄积的药物量减少，从而不能有效抑制真菌生长，导致真菌耐药。真菌细胞膜上磷脂及固醇组成发生变化，影响到细胞膜的流动性和不对称性，导致对药物的被动扩散和主动转运功能下降，从而降低细胞内抗真菌药物浓度。Mansfield等［13］证实唑类通过不耗能的易化扩散被白念珠菌和其他致病真菌摄取，而且所有唑类被摄取的机制相同，都是由转运蛋白介导。因此，转运蛋白发生突变可导致唑类交叉耐药。

2.4 多药耐药蛋白（MDR）与念珠菌耐药

真菌细胞内的药物浓度降低，除细胞膜对药物的通透性下降外，还可由药物外排增多引起。后者是由两种多药耐药蛋白（MDR）介导［14］的耐药机制。

MDR蛋白属于外排泵转运蛋白，包括ATP结合盒转运子家族 （ATP⁃binding cassette transports，ABC）与主要易化子超家族（the major facilitator su⁃perfamily，MFS）。前者与念珠菌耐药相关的外排泵编码基因为CDR1和CDR2，后者与耐药相关的基因为MDR。Cdr1p、Cdr2p增加药物的外排，Mdr1p抑制摄入降低胞内药物浓度。但耐药菌株对这两种蛋白的上调不需同步进行。而且CDR和MDR分别表达时，念珠菌表现出的耐药性所针对的药物种类也有所差别。CDR针对的主要是脂溶性分子，大多数唑类药物如伊曲康唑、酮康唑是脂溶性的。在耐药念珠菌菌株中，CDRl基因的mRNA水平可增高5～8倍。Manoharlal等［15］发现唑类耐药株CDR1 mRNA半衰期较敏感株长，还进一步证实了PAP1基因杂合性缺失与唑类耐药株CDR1 mR⁃NA稳定性的关系［16］。Cdr2p其氨基酸序列有84%与Cdr1p的氨基酸序列相同，但CDR2基因介导的耐药水平低于CDRl基因。和CDR相比，对MDR的研究较少，目前认为其主要针对水溶性分子如氟康唑。

此外，外排泵基因的表达受转录因子TAC1和MRR1的调控［14］。Coste等［17］报道纯合子念珠菌菌株具体高活性的TAC1，高活性的TAC1导致CDR1和CDR2的高表达，可增强对氟康唑的耐药。TAC1的高活性仅存在于纯合子中，因此该基因杂合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）也与唑类耐药有关［17］。此外，Morschhäuser等通过对比3株高表达MDR1的白念珠菌临床分离株和唑类敏感株，发现3株MRR1都上调［14］。

2.5 固醇合成旁路下游的改变与念珠菌耐药

这种耐药机制主要是针对唑类药物产生的。唑类一方面通过结合靶酶抑制麦角固醇的合成，另一方面通过旁路将无毒的14α⁃甲基粪固醇转变成毒性甾醇14α⁃甲基⁃3，6⁃二醇，后者由Δ5，6⁃甾醇去饱和酶催化。缺乏麦角固醇和14α⁃甲基⁃3，6⁃二醇的堆积共同抑制了真菌的生长。如果ERG3基因发生突变，不能产生有活性的Δ5，6⁃甾醇去饱和酶，使细胞内累积的是14α⁃甲基粪固醇而不是14α⁃甲基⁃3，6⁃二醇，前者能部分替代麦角固醇的功能，维持真菌细胞生长，从而对唑类耐药。另有报道，EFG1参与ERG3基因表达调节，EFG1发生突变后增加对唑类的敏感性［18］。

2.6 生物膜的形成与念珠菌耐药

念珠菌细胞具有酵母相和菌丝相两种状态。酵母细胞在宿主体内并不单独存在，而总是聚集形成生物膜［2］。生物膜是指微生物分泌于细胞外的多糖蛋白复合物，将自身包裹其中于生物表面形成的膜状物，实质是细胞外基质。其重要后果是使真菌对多种唑类药物呈现高度耐药性，敏感性下降几十倍甚至几百倍。生物膜形成所致的高度耐药性可能与下列因素有关［19］：①膜内真菌生长速率慢。②胞外聚合物基质所形成的膜屏障作用。③表面诱导耐药基因的表达。④膜表面甾醇代谢异常。⑤细胞的异质性，大量菌丝细胞的存在。⑥上调外排泵基因。⑦膜内存在持续程序细胞。

2.7 分泌型天冬氨酸蛋白酶（Sap）与念珠菌耐药

分泌型天冬氨酸蛋白酶（Secreted aspartic pro⁃teinase，Sap）在1965年首次被描述，并被命名为念珠菌酸性蛋白酶，主要因其首次发现于念珠菌属，且在酸性环境中具有最佳活性而得名。以往对其研究较多的是Sap与念珠菌致病性的关系，而Sil⁃va［2］等首次提出Sap在念珠菌耐药形成中存在一定作用。

目前，Sap的研究主要集中在白念珠菌，其他非白念珠菌的研究较少。白念珠菌的Sap由10个SAP基因家族编码，后者可分为6个亚家族：SAP1⁃3，SAP4⁃6，SAP7，SAP8，SAP9，SAP10［2］。念珠菌毒力相关因子包括黏附能力、生物膜形成能力、菌丝形成、表型转换、溶血素、水溶酶的分泌等。其中最重要的毒力相关因子是水溶酶，而Sap被认为是念珠菌最重要的水溶酶，与念珠菌黏附、侵袭和组织损伤有关。基因测序表明，非致病念珠菌编码Sap的基因通常较机会性致病菌少。可见，Sap在念珠菌的致病性中有重要作用。

文献报道，感染氟康唑耐药的白念珠菌患者，给予常规剂量的氟康唑治疗，可导致患者发生持续性感染，主要是因为Sap的分泌增加。Wu等［20］对其研究发现，将白念珠菌分离株培养在亚抑制浓度的氟康唑中，表现为Sap产生增加，且和氟康唑耐药性增高相关。该研究还观察到，氟康唑敏感株表现为Sap活性下降，而耐药株则表现为Sap活性增高，并取决于氟康唑的给药剂量。此外，Costa等［21］报道唑类耐药的分离株在唑类药物存在的情况下Sap活性增高，而敏感株Sap活性无明显增高。Kumar等也有相似报道，发现对两性霉素B耐药的念珠菌分离株比敏感株表现出更强的蛋白水解活性［22］。

最新文献报道，暴露在亚抑制浓度的抗真菌药物中，可促进耐药株的形成，并伴有Sap分泌增加和蛋白水解活性增高［2］。Becker等［23］认为念珠菌致病性与抗真菌药物的耐药之间存在一定关系。暴露在亚抑制浓度的抗真菌药物中，可能刺激念珠菌毒力相关因子的表达 （如Sap），导致真菌致病性增强，从而产生耐药。此外，Puri等［24］对白念珠菌研究报道，Sap通过水解Msb2黏蛋白，激活Cek1 MAPK信号途径影响生物膜的形成。Sap抑制剂的使用或Sap突变可导致MAPK信号途径受阻，伴有生物膜形成缺陷和毒力下降。所以，Sap也可能通过影响生物膜形成，间接导致真菌耐药。目前关于SAP基因表达的研究较少，且主要集中在白念珠菌。Sap在真菌耐药机制中的作用尚不明确，有待进一步研究。通过对Sap的深入研究，可能为真菌治疗提供新的靶点和思路。

3 结 语

和细菌耐药的发生率相比，念珠菌耐药的发生率相当低。念珠菌病不是传染性疾病，因此，罕见发生患者间的耐药传播。此外，在酵母细胞中，耐药机制也不能通过质粒转移。可见，抗真菌药的暴露是获得性耐药形成的必备条件。真菌耐药性的产生可能是上述单独一种机制或者几种机制共同作用的结果，还可能与其他一些因素有关，如细胞免疫低下或缺陷易导致耐药菌株产生、药物与机体感染状况对真菌耐药性有诱导作用，菌株的耐药性可能经遗传获得等。念珠菌病发病率的增高和治疗的困难要求临床医生应该更好地理解念珠菌的耐药机制，合理规范地使用抗真菌药。真菌耐药性问题的解决将是一个长期和艰巨的任务。深入探讨真菌的耐药机制，将为真菌耐药的治疗提供新的线索和方向。

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The research progress on antifungal resistance mechanisms of Candida spp.

HE Xiao⁃yuan，ZHAO Ming⁃feng
（Department of Hematology，Tianjin First Central Hospital，Tianjin 300192，China）

In recent years，the incidence and mortality of fungal infection，especially the opportunistic fungal infection have been increasing.This is mainly associated with antifungal resistance and the restricted number of available antifungal drugs.Candida species are opportunistic fungi in human body.The common antifungal resistance mechanisms include the changes of the target enzyme，the lack of target site，the drug permeability decline of fungal cell membrane，the increased expression of multi⁃drug resistance protein，the change of cholesterol synthesis bypass，the biofilm formation and so on.The latest literature reports that secreted aspartic proteinases have a role in antifungal resistance of Candida spp.In this article，the epidemiology of Candida spp.infection and its possible antifun⁃gal resistance mechanisms are reviewed briefly.

Candida spp；antifungal resistance；resistance mechanisms；secreted aspartic proteinase

R 379.4

A

1673⁃3827（2015）10⁃0049⁃05

2014⁃05⁃20

［本文编辑］ 施 慧

天津市自然科学基金 （13JCYBJC23400），天津市卫生局科技基金攻关项（13KG106）

贺小圆，女（汉族），硕士研究生在读.E⁃mail：hexiaoyuan09＠126.com

赵明峰，E⁃mail：zmfzmf＠hotmail.com