餐厨垃圾微生物发酵生产蛋白饲料的工艺优化

蔡 静，张紊玮，贠建民，武建祯

（甘肃农业大学 食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070）

餐厨垃圾微生物发酵生产蛋白饲料的工艺优化

蔡 静，张紊玮，贠建民*，武建祯

（甘肃农业大学 食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070）

以餐厨垃圾为原料，采用酵母菌、黑曲霉和枯草芽孢杆菌作为混合发酵菌剂进行固态发酵，结合正交试验，建立并优化了餐厨垃圾转化为生物活性蛋白饲料的工艺条件。结果表明，最佳发酵工艺为以酿酒酵母∶枯草芽孢杆菌∶黑曲霉（1∶1∶2）为混合菌剂，接种量1.0%，尿素添加量1.0%，30℃发酵48 h，含水量60%，在此发酵条件下发酵产物中粗蛋白含量提高了58.7%；粗纤维、粗淀粉和粗灰分含量均显示下降；氨基酸总含量增加了1.08倍，其中必需氨基酸含量提高了95.9%；维生素B1、B2的含量也有显著提高；微生物指标均符合国家饲料卫生标准（GB/T 5009.23—2006）。

餐厨垃圾；菌体蛋白；多菌发酵；工艺优化

餐厨垃圾是家庭、饮食单位抛弃的剩饭剩菜以及厨房残余物的统称，主要包括米和面粉类、蔬菜、动植物油、肉骨等食物残渣，含水率高、成分复杂、营养成分高[1]，极易腐烂变质、散发恶臭、传播细菌和病毒[2]。随着社会的发展，人们生活水平的不断提高，餐厨垃圾的产量也在逐年上涨[3-4]。目前我国餐饮垃圾的处理方法有以下几种：直接排放、填埋、焚烧、堆肥，虽然这些方法处理了餐厨垃圾，但是均会产生不利影响[5-8]。餐厨垃圾营养成分很高，并没有将餐厨垃圾资源化利用[9]。此外，餐厨垃圾大多数被直接用作动物饲料，由于其可能含有口蹄疫病菌、猪瘟病菌、弓形虫、沙门氏菌等病原菌，未经处理直接饲养畜禽，会将其中的病菌通过食物链传染给食用者，进一步对人体造成危害，形成恶性循环[10-11]，后果不堪设想。随着畜牧业和饲料工业的发展，蛋白饲料的不足将成为全球性的问题。由于对蛋白饲料资料认识不足，不少可以开发的资源却未能得到有效利用[12-13]。然而利用微生物将有机废物转化为蛋白质，生产的生物饲料具有消化吸收率高、适口性好，增加动物的采食量等优点[14]，不仅能够提高资源的利用效率，而且对消除环境污染、改善生态环境都具有重要意义[15]。本试验以餐厨垃圾为原料，采用多菌协生固态发酵技术，使微生物间进行有效的优势互补[16]，以枯草芽孢杆菌、黑曲霉、酿酒酵母为发酵菌种，结合正交试验设计方法对餐厨垃圾转化为生物活性蛋白饲料的工艺条件进行了优化研究，旨在为餐厨垃圾的资源化高效利用提供技术支撑和依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

餐厨垃圾：甘肃农业大学学生二号食堂。

1.1.2 菌种

酿酒酵母（Saccharomyces cerivisia）、黑曲霉（Aspergillus niger）、枯草芽孢杆菌（Bacillu ssubtilis）均为食品科学与工程学院微生物发酵实验室自行保存。

1.1.3 培养基

酵母培养基：葡萄糖10 g，麦芽糖10 g，蛋白胨5 g，酵母粉5 g，NaCl5 g，蒸馏水1 000 mL，用于培养酵母菌。

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯（去皮）200 g、蔗糖（或葡萄糖）20 g、水1 000 mL，pH值自然，用于培养黑曲霉。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂20 g，水1 000 mL，pH值7.0～7.2，用于培养枯草芽孢杆菌。

固体发酵基础培养基：经过预处理的餐厨垃圾用匀质机打浆，121℃灭菌20 min即为发酵基础培养基。

1.1.4 试剂

硫酸钾（分析纯）：天津市巴斯夫化工有限公司；硫酸铜（分析纯）、酒石酸钾钠（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；氢氧化钠（分析纯）：成都市科龙化学试剂厂；硼酸（分析纯）、乙醚（分析纯）：天津市光复精细化工研究所。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-1FD超净工作台：苏净集团苏州安秦空气技术有限公司；ATN-300半微量凯氏定氮仪、SXT-06索氏提取器：天长市长城玻璃仪器制造厂；DH-600A恒温培养箱：北京科伟永兴仪器有限公司；101-1-S-Ⅱ鼓风干燥箱：上海跃进医疗器械厂；FA1004B分析天平：上海佑科仪器仪表有限公司；HHS恒温水浴锅：上海博迅实业有限公司；WFX-110B/120B/130B原子吸收分光光度计：北京北分瑞利分析仪器（集团）公司。

1.3 方法

1.3.1 分析方法

粗蛋白的测定参照GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》；氨基酸组成和含量测定参照GB 5009.124—2003《食品中氨基酸的测定》；粗淀粉的测定参照GB/T 20194—2006《饲料中淀粉含量的测定》；还原糖的测定参照GB 5009.7—2008《食品中还原糖的测定》；粗灰分的测定参照GB 5009.4—2010《食品中灰分的测定》；粗纤维的测定参照GB 5009.10—2003《植物类食品中粗纤维的测定》；维生素B1、B2参照GB/T 14700—2002《饲料中维生素B1的测定》；矿质元素采用原子吸收分光光度法；黄曲霉毒素B1的测定参照GB/T 5009.23—2006《食品中黄曲霉毒素Bl、B2、Gl、G2的测定》；病原菌的检测：参照GB 4789.4—2010《食品微生物学检验沙门氏菌检验》等系列国家标准方法。

微生物指标测定：取发酵物样品1 g置于9 mL无菌水中，充分混匀后，取1 mL进行梯度稀释，选取合适的稀释液分别涂布于适宜的培养基平板，37℃培养30 h，计数平板中的菌落数。

1.3.2 生产蛋白饲料的工艺流程

1.3.3 餐厨垃圾的采集及基本成分分析

餐厨垃圾取自甘肃农业大学学生二号食堂，主要是餐饮消费剩余的米面主食及植物类菜品。初步分拣去除一次性筷子、餐盒、纸巾等不可利用物，离心、去除部分水分，拌入10%～18%农产品加工副产物，置于4℃备用，经过以上方法处理的固体原料为研究对象。对主要的几类食物残余物，包括米和面粉主食类、蔬菜类、动植物油、肉骨类等基本成分进行分析，主要是化学成分分析，测定其中的粗蛋白、粗纤维、粗灰分、粗淀粉及还原糖含量。

1.3.4 菌种活化及液体菌种的制备

将菌种从4℃冰箱取出，无菌操作，用接种环挑取于相应固体培养基上培养24～48 h，作为斜面菌种。将活化好的斜面菌种无菌操作向250 mL液体培养基中接入少量菌种，150 r/min培养48～72 h，作为种子液。

1.3.5 最佳蛋白饲料的工艺条件的确定

分别研究接种量、混合菌种接种比例对餐厨垃圾发酵生产蛋白饲料的的影响，再依据单因素试验结果，设氮源、含水量、温度、发酵时间4个因素，以粗蛋白含量为评价指标确定最佳工艺条件。

1.3.6 发酵产物品质分析及安全性评价

研究发酵产物的主要理化成分及营养价值，开展生物安全性检测及评价。

2 结果与分析

2.1 餐厨垃圾成分分析

对餐厨垃圾的基本成分分析，以便选择不同发酵菌种、调整基础培养基组成，为发酵试验打下基础，其结果见表1。

由表1可知，餐厨垃圾中含有较丰富的可供微生物发酵利用的碳源、氮源和矿质营养物质，可以作为微生物的基质发酵再利用。

2.2 菌种发酵试验

2.2.1 单一菌种对固体发酵的影响

在餐厨垃圾中分别接入1.0%的黑曲霉、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母3种不同菌种，考察其在25℃条件下发酵48 h，对固体发酵的影响结果见图1。

由图1可知，向固体发酵发酵培养基中接入各种供试菌种均能显著提高发酵产物的粗白含量。在相等的接种比例下，相同的培养条件下，黑曲霉对固体发酵培养基的粗蛋白含量的增幅最高，达到20.21%，由此确定出单一菌种发酵的最佳菌种为黑曲霉。

2.2.2 黑曲霉添加量对固体发酵的影响

接种量的大小会影响微生物生长繁殖的速度。因此，本试验研究了不同接种量0.5%、1.0%、1.5%黑曲霉，考察在25℃条件下发酵48 h对固体发酵的影响，结果见图2。

由图2可知，不同黑曲霉接种量相同的培养条件下，接种量为1.0%对固体发酵培养基的粗蛋白含量的增幅最高，达到20.21%，因此黑曲霉最佳接种量为1.0%。

2.2.3 混合菌种对固体发酵培养基的影响

在发酵基质中按接种量1.0%，分别接入酿酒酵母∶枯草芽孢杆菌∶黑曲霉以不同混合比例1∶1∶2、1∶2∶1、2∶1∶1、1∶2∶2、2∶2∶1、2∶1∶2、1∶1∶1菌种种子液，在25℃条件下发酵48 h，考察其对固体发酵的影响，结果见图3。

由图3可知，相同的培养条件下，接种酵母菌、黑曲霉、枯草芽孢杆菌混合菌种，当酿酒酵母∶枯草芽孢杆菌∶黑曲霉的接种比例为1∶1∶2时，发酵产物中的粗蛋白含量最高，达到21.82%。由此确定出混合菌种最佳接种比例为1∶1∶2。

2.3 混合菌种发酵条件优化

2.3.1 氮源种类对固体发酵的影响

氮源是微生物生长和产物合成的必要保障，直接影响发酵产物中粗蛋白的含量。因此，以混合菌种最佳接种比例为1∶1∶2，在氮源的添加量相同的条件下（添加量为1.0%），加入不同氮源种类时（磷酸二氢铵、硫酸铵、尿素），考察不同氮源在25℃条件下发酵48 h对固体发酵的影响，其结果见图4。

由图4可知，在相同的培养条件下，磷酸氢二铵、硫酸铵、尿素这三种氮源均可以提高固体发酵粗蛋白的含量。在添加量为1.0%的情况下，尿素对固体发酵粗蛋白含量的增幅高于其他氮源，因此，选择尿素作为固体发酵的最适氮源。

2.3.2 尿素的添加量对固体发酵的影响

以尿素为最佳氮源，考察其在不同的添加量0.5%、1.0%、1.5%对混合菌种在25℃条件下发酵48 h，考察尿素的添加量对固体发酵产物粗蛋白含量的影响，其结果见图5。

由图5可知，当尿素添加量为1.0%时，固体发酵培养基的粗蛋白含量可达23.51%。因此最佳尿素添加量为1.0%。

2.3.3 不同含水量对固体发酵的影响

含水量过低，造成基质膨胀程度低，微生物生长受到抑制；含水量过大，难以通风降温，造成产品的粗蛋白降低，而且使产品容易染菌。因此对不同含水量30%、40%、50%、60%、70%对固体发酵的影响进行了研究，结果见图6。

由图6可知，在相同的培养条件下，随着含水量的增加，固体发酵培养基中的粗蛋白含量升高，含水量达到60%时，粗蛋白含量最高，为23.23%。但当含水量＞60%，粗蛋白含量降低。由此确定固体发酵最佳含水量为60%。

2.3.4 不同温度对固体发酵的影响

温度直接影响着微生物生长和代谢。由于是多种微生物对餐厨垃圾进行发酵，每种微生物具有不同的最佳生长温度，因此要研究不同温度25℃、30℃、35℃对固体发酵的影响，其结果见图7。

由图7可知，在相同的培养条件下，培养温度为30℃时，发酵培养基中的粗蛋白含量最高，达到24.02%。由此确定固体发酵最佳温度为30℃。

2.3.5 不同发酵时间对固体发酵的影响

发酵时间太短，微生物代谢产物积累少，粗蛋白含量少；发酵时间太长，影响产品品质。探究发酵时间对固体发酵的影响，其结果见图8。

由图8可知，在相同的培养条件下，培养时间为48 h时，发酵培养基中的粗蛋白含量最高，达到24.48%。由此确定固态发酵最佳培养时间为48 h。

2.4 正交试验优化固体发酵条件

根据单因素试验结果，进行4因素3水平的正交试验，以餐厨垃圾发酵过程中产品粗蛋白含量为考察指标，正交试验结果与分析见表2，方差分析见表3。

由表2可知，对发酵产物粗蛋白含量影响由大到小依次为尿素添加量＞含水量＞发酵时间＞发酵温度，A2B2C2D2为最优组合，即在以酿酒酵母∶枯草芽孢杆菌∶黑曲霉（1∶1∶2）为混合菌剂，接种量1.0%的基础上，尿素添加量1.0%，培养基含水量60%，发酵时间48 h，发酵温度30℃。在此最佳条件下进行验证试验，最终产品中粗蛋白含量达到25.07%。

由表3可见，尿素添加量对发酵产物中粗蛋白含量的影响显著，发酵时间、含水量、发酵温度对粗蛋白含量的影响不显著。因素作用的主次顺序是尿素添加量＞含水量＞发酵时间＞发酵温度，与极差分析得出的结果一致。

2.5 发酵产物主要理化成分及营养价值分析

2.5.1 营养价值分析

完成蛋白饲料生产工艺条件进行了优化后，对该工艺下的产品营养价值进行了分析。餐厨垃圾常规营养成分组成（以干物质计）分析测定结果见表4，菌体蛋白饲料矿质元素测定结果见表5，氨基酸组成与维生素含量的测定结果见表6。

由表4可知，发酵后的餐厨垃圾中粗蛋白含量比原料提高了58.7%，粗纤维、粗淀粉、粗灰分均有较大程度的下降，尤其是粗纤维含量降低幅度较大，减少了58.2%，说明餐厨垃圾发酵后营养价值得到了提高，适口性得到了明显的改善。

由表5可知，发酵饲料中的矿质元素丰富，尤其是Ca、P、K、Mg含量最为丰富。

由表6可知，氨基酸总含量提高了1.08倍，必需氨基酸含量提高了95.9%，维生素B1、B2的比例也得到了提高。因此饲料的营养价值得到了提高。

2.5.2 卫生指标测定

以菌体蛋白饲料中生物毒素的含量及是否存在致病菌为指标来开展安全性评价，其结果见表7。

由表7可知，餐厨垃圾菌体蛋白饲料中的黄曲霉毒素检测结果在国家饲料卫生标准之下，而致病菌（沙门氏菌）未检测出来，说明用该工艺生产出的蛋白饲料是安全的。

3 结论

采用多菌协生混合发酵技术原理，将3种有益微生物复配，对餐厨垃圾转化为生物活性蛋白饲料的工艺条件开展了优化研究。

在以酿酒酵母∶枯草芽孢杆菌∶黑曲霉1∶1∶2为混合菌剂，接种量1.0%，添加1.0%尿素，发酵温度30℃，发酵48 h，发酵产物中粗蛋白含量为25.07%，与原来未经处理前相比，提高了58.7%。粗纤维、粗淀粉、粗灰分均有大程度下降，尤其是粗纤维含量降低幅度较大，减少了58.2%，适口性到明显改善。氨基酸总含量提高了1.08倍，必需氨基酸含量提高了95.9%，维生素B1、B2的比例也得到了提高，营养价值和风味都得到了较大的改善。微生物指标均符合国家饲料卫生标准，具有良好的安全性。

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Optimization of microbial fermentation process to produce protein feed from kitchen waste

CAIJing,ZHANG Wenwei,YUNJianmin*,WU Jianzhen

(College of Food Science and Engineering,Gansu AgriculturalUniversity,Lanzhou 730070,China)

Using kitchen waste as raw material,Saccharomyces cerevisiae,Aspergillus niger and Bacillus subtilis as mixed fermentation starter,combining with orthogonaltest,the protein feed solid-state fermentation processing condition was optimized.The results showed thatthe optimum fermentation process was S.cerevisiae∶B.subtilis∶A.niger(1∶1∶2),inoculum 1.0%,urea addition 1.0%,temperature 30℃,time 48 h,and moisture 60%. Under these conditions,crude protein contentof fermentation productincreased 58.7%;the crude fiber,starch and ash content decreased;total amino acid content increased 1.08 times,in which the essential amino acid content increased 95.9%;vitamin B1,B2content significantly increased,and the microbialindexes metthe NationalFeed Hygiene Standards(GB/T5009.23—2006).

kitchen waste;mycoprotein;mixed-microbe fermentation;process optimization

TS264.2

A

0254-5071（2015）02-0114-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.026

2014-11-25

国家级大学生创新创业训练计划项目（201310733002）

蔡 静（1992-），女，本科生，研究方向为发酵微生物。

*通讯作者：贠建民（1968-），男，教授，博士，研究方向为微生物发酵工程。