酱油酿造风味菌株T酵母耐盐机理的初步研究

王 聪，王 檬，赫景钰，王春玲，侯丽华

（天津科技大学 食品工程与生物技术学院，天津 300457）

酱油酿造风味菌株T酵母耐盐机理的初步研究

王 聪，王 檬，赫景钰，王春玲，侯丽华*

（天津科技大学 食品工程与生物技术学院，天津 300457）

通过模拟高渗环境来对用于酱油发酵的T酵母（Candida versatilis）耐高渗的机理进行研究。利用高效液相色谱对不同盐度条件下胞内甘油进行动态测定发现当T酵母进入到高渗环境中，胞内的甘油在20 min之内就迅速积累到最高值，而且16%盐度下的含量要高于不含盐和8%盐度下的甘油含量。利用实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）对耐高渗基因的表达变化考察发现GPD1和FPS1基因的表达变化趋势与甘油的变化趋势相吻合，表明了T酵母能够耐高渗是由于甘油的合成迅速同时外排通道被关闭，使得胞内甘油的含量升高，保证T酵母的正常生长。

T酵母；耐盐机理；甘油；实时定量PCR

酱油主要通过豆粕和炒小麦混合制曲，米曲霉、酵母菌、乳酸菌等微生物共同发酵酿造而成。参与酱油发酵比较有代表性的耐盐产香酵母主要有鲁氏酵母、T酵母（Candida versatilis）以及结合酵母[1-2]。在高盐稀态酿造酱油中，T酵母作为后熟酵母可以利用酱醪中的糖类物质生成大量的风味物质如：乙醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯以及4-乙基愈疮木酚等，这些物质是酱油具有独特香气和味道的奥秘之所在[3-4]。

酱醪的成分比较复杂且具有较高的渗透压，T酵母由于对高渗环境具有一定的抵抗能力因而在酱醪中能够正常生长，其他杂菌的生长则受到抑制。在高渗环境中，酵母一般会通过在体内积累一些相容性溶质来保护细胞，防止胞内的水分子外流。通常酵母体内的相容性的溶质主要分为三大类分别是：Na+/K+离子的动态平衡，氨基酸以及多羟基化合物。其中多羟基化合物研究的最多的就是甘油[5-6]。BROWN A D等[7-8]发表了对甘油和海藻糖在保护细胞内的可溶性酶和维持细胞膜稳定性等方面的研究成果。但是目前对鲁式酵母的耐盐机制研究比较多而T酵母的耐高渗机制的研究还很少[9-10]。

由于酱醪的成分比较复杂因此通过模拟高渗环境能够减少其他因素产生的影响。本实验采用高效液相色谱法对不同时间点不同高渗环境条件下细胞内外的甘油含量变化进行测定，同时利用实时定量聚合酶链反应（realtime quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）的方法从转录水平上考察耐盐相关基因的表达变化，并将甘油含量变化和耐盐相关基因的表达变化相互结合来共同对T酵母的耐盐机理进行初步的探讨，为工业酱油的生产和管理提供了基础的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验菌株

T酵母（Candida versatilis）：天津科技大学菌种保藏中心提供。

1.1.2 培养基配制

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基：酵母提取物1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%。（YPD固体培养基加入2%的琼脂粉），115℃灭菌20 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖加盐（yeastextractpeptone dextrose with NaCl，YPDN）培养基：酵母提取物1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，不同含量的NaCl（实验设计需要）115℃灭菌20 min。

1.1.3 主要试剂

酵母提取物（分析纯）：美国OXOID公司；蛋白胨（分析纯）、葡萄糖（分析纯）：天津市化学试剂一厂；甘油标品（分析纯）：博欧特天津化工贸易有限公司；乙腈（色谱纯）：天津市康科德科技有限公司；超纯水实验室自制（Mili-Q，美国）。

1.2 仪器与设备

721型可见分光光度计：上海舜宇衡平科学仪器有限公司；Thermo Sorvall ST 16R冷冻离心机：美国赛默飞世尔科技有限公司；LG WP700微波炉：乐金电子电器有限公司；Thermo Arktic PCR仪：美国赛默飞世尔科技有限公司；Bio-Rad Powerpac Basic电泳仪：伯乐生命医学产品（上海）有限公司；岛津LC-20AB高效液相色谱：日本岛津公司；Eppendorf Mastercycler ep realplex实时定量荧光PCR系统：德国艾本德公司。

1.3 方法

1.3.1 引物设计

以美国国家生物技术信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）网站上提供的鲁式酵母中GPD1、FPS1和GAPDH基因的序列为模板，利用Primer Premier5.0软件设计引物，目的片段合成大小约为100～200bp。GPD1上引为：5′-CTATCTGGTGCTAACTTGGC-3′，下引为：5′-AAGTATGGTCTGTGG AACAA-3′；FPS1上引为：5′-CTGACCGATCCATATACTTC-3′，下引为：5′-TCTTG CCATATTCATTGCTG-3′；GAPDH上引为5′-AGACTGT TGACGGTCCATCC-3′，下引为：5′-CCTTAGCAGCACCGG TAGAG-3′。

1.3.2 不同盐含量下生长曲线的测定

取培养到对数期的T酵母菌悬液，将其按初始5×106个/mL的浓度分别接入到200 mL的0、8%、16%盐含量的YPDN培养基中，30℃、180 r/min恒温培养。自接种时间起每隔12 h取一次样，用紫外可见分光光度计在波长600 nm处测其光密度OD值[11]。

1.3.3 酵母胞内甘油的提取

将特定时间点取得的样品在25℃、3 000 r/min下离心5 min，将上层培养液舍去。将得到的酵母菌体用1 mL冰冷的无菌水重悬，然后3 000 r/min离心3 min，重复洗涤2次。其中一管的T酵母菌菌体在80℃的烘箱中烘至质量恒定，计算每毫升发酵液中菌体的干质量。另外一管的T酵母菌体利用功率为700 W的微波炉进行破碎，每次微波处理时间为1 min，时间间隔为30 s。然后加入1 mL的去离子水，涡旋1 min。最后在冰浴条件下反复抽提3次，每次20 min。抽提完毕后12 000 r/min离心5 min。吸取上清液并用0.22μm的微孔滤膜过滤，过滤完成后的抽提液即可用于测定酵母胞内甘油的含量。酵母胞内甘油含量定义是每克菌体中所含的甘油的质量[12-13]。

1.3.4 甘油含量的测定

（1）标准曲线的制作[14]

分别准确称取甘油标准品1.5 g，用体积分数为70%的乙腈溶液溶解甘油并最终定容到100 mL的容量瓶中，使甘油的最终质量浓度为15.00 mg/mL。以配制好的甘油标准液为基础，分别稀释成3 mg/mL、6 mg/mL、9 mg/mL、12 mg/mL、15 mg/mL的甘油标准液。将色谱纯乙腈和去离子水按照7∶3的体积比混合均匀后，经0.45μm的有机相微孔纤维素滤膜抽真空过滤除去流动相中的杂质，流动相使用前超声30 min除去空气。待检测器平衡之后待基线走平就可以将不同浓度的标准品按次序依次进样，以保留时间定性，以峰面积定量。

（2）样品种的甘油含量测定

将特定时间点得到的细胞内外甘油样品依次进样，以保留时间定性，以峰面积定量。根据测得的峰面积代入到标准曲线求出样品中甘油的含量。在分析数据时要根据具体的情况手动积分减少杂质干扰产生的误差。

（3）高效液相色谱检测分析条件[15]

色谱柱为Inertsil氨基柱（5μm，4.6 mm×300 mm）；柱温为30℃；流速为1.00 mL/min；检测器为示差检测器RID-10A；进样量为10μL。

1.3.5 酵母核糖核酸的提取

核糖核酸（ribose nucleic acid，RNA）的提取方法参考JINMAIJ等[16]的方法进行，提取后的RNA要立即进行电泳验证。

1.3.6 酵母RNA的反转录

酵母总RNA验证之后，按照TaKaRa反转录试剂盒说明书将总RNA反转录成cDNA，作为实时定量PCR的模板。将说明书中的各组分混合到PCR管中，短暂离心后进行反转录。整个反转录的程序为：37℃反转录15 min，重复3个循环，反转录完全，然后85℃处理5 s，使反转录酶失活，然后4℃恒温。

1.3.7 实时定量PCR

以反转录完成的cDNA为模板，按照TaKaRa实时定量PCR试剂盒说明书进行定量PCR试验，按照说明分别将体系中的组成分混合到Axygen八联管中，短暂离心后进行定量PCR实验。整个定量PCR的程序为：95℃变性5 s。然后两步法PCR，95℃变性5 s，50℃处理30 s，两步法共40个循环，最后加上溶解曲线程序。以GAPDH作为内参基因，实验前摸索cDNA的浓度和循环数之间的关系，保证基因的Ct值在18～30之内。每次实时定量PCR要设没有模板的阴性对照和加有内参的阳性对照。每个基因相对于同一个模板的定量PCR重复3次。将所得的Ct值导出，按照相对定量法2-△△Ct法对基因的表达量进行计算[17-18]。

2 结果与分析

2.1 不同盐含量下生长曲线的测定

3种不同盐含量下T酵母的生长曲线见图1。

由图1可知，不同盐度条件下的酵母在12 h之后陆续进入对数期，开始进行指数规模的生长。在此之前酵母菌已经产生对环境的适应能力，因此选择在12 h之内选取时间点来对酵母的耐高渗能力进行研究。

2.2 甘油含量的测定

2.2.1 甘油标准曲线

利用高效液相色谱法测定甘油含量的标准曲线如图2所示，横坐标代表不同含量（x）的甘油标品，纵坐标代表色谱峰的峰面积（y）。

由图2可知，甘油标准曲线的回归方程为y=48 603x+ 1 978.3，相关系数R2为0.997，说明二者线性关系良好。结果表明，高效液相色谱对甘油检测的特异性很好，而且检出限比较低，重复性比较好，因此可以用来作为酵母胞内、胞外甘油含量检测的一种比较好的方法。

2.2.2 不同盐含量下胞内和胞外甘油含量变化

由图3可知，当T酵母进入到高渗环境中，胞内的甘油开始积累，而且盐度越高，胞内的甘油的含量也越多。胞内甘油含量的增加十分迅速，在无盐、8%盐度条件下，T酵母在进入到环境20 min左右就已经达到了最大值，而随后又开始缓慢下降，而在16%盐度条件下，T酵母体内的甘油积累最快，而且随着时间的推移胞内甘油含量的降低速度远远低于中低盐度条件下的下降速度。说明T酵母进入环境后，细胞会通过迅速的合成甘油来保证胞内的渗透压，使得细胞免受损伤，而且胞外盐度越高，胞内甘油的含量也会越高。而在20 min左右3种盐度条件下胞内的甘油的含量都达到最大值，而16%盐度下胞外甘油含量却降低到最低值，无盐和8%盐度下的胞外甘油含量却在50 min左右达到最低值。这表明了T酵母进入高渗环境后在提高胞内甘油的合成速度同时也会从环境中积累一部分甘油来共同达到平衡内外压力的目的。

2.3 T酵母RNA电泳图

图4显示了酵母RNA的电泳结果，第一条为28S，第二条带为18S，第三条带为5S。电泳结果显示RNA提取过程发生降解，但是三条带很清晰，反转录后可以作为实时定量PCR的模板。

2.4 耐盐的基因溶解曲线

利用实时定量PCR仪对耐盐基因的溶解曲线进行测定，结果见图5。

由图5可知，这几个基因的溶解曲线都是单一的重叠峰说明引物的特异性比较好。整个PCR过程的Ct值也在15～30的合理区间，因此可以用来考察这些基因在不同的cDNA模板中表达情况的变化。

2.5 不同盐度下GPD1基因表达量变化

以起始时间GPD1基因的表达量作为参考，利用相对定量法考察不同取样时间点GPD1基因的表达量变化情况，结果见图6。

GPD1基因主要参与3-磷酸甘油脱氢酶的合成，是HOG-MAPK途径介导的甘油合成的主要基因[19-20]。由图6可知，在进入高渗环境不久，T酵母的GPD1基因的表达量开始上升并且高盐度条件下GPD1的基因表达量明显高于低盐度水平下的表达量。进入环境20 min左右，GPD1在T酵母中的表达量达到最大，然后随着培养时间段的延长其表达量开始缓慢的下降。通过和测定的胞内外甘油含量的变化情况进行比对可以发现，在20 min左右时胞内的甘油含量达到最高随后开始缓慢下降而此时GPD1的表达量也达到最高值，但是由于基因表达调控相对于甘油的合成还具有一定的滞后性，所以可以推测在酵母细胞进入环境20 min后甘油的合成量仍然很高，但此时细胞膜的通透性发生改变使得部分甘油外排到环境中，实际测得胞外甘油含量的变化也印证了这一推测。

孟子见梁襄王。出，语人曰：“……卒然问曰：‘天下恶乎定？’吾对曰：‘定于一。’‘孰能一之？’对曰：‘不嗜杀人者能一之。’‘孰能与之？’对曰：‘……今夫天下之人牧，未有不嗜杀人者也。如有不嗜杀人者，则天下之民皆引领而望之矣。诚如是也，民归之，由水之就下，沛然谁能御之？’”[4](P207)

2.6 不同盐度下FPS1基因表达量变化

以起始时间FPS1基因的表达量作为参考，利用相对定量法考察不同取样时间点FPS1基因的表达量变化情况，结果见图7。

FPS1在酿酒酵母体内主要编码细胞膜上的通道蛋白，属于主体蛋白（major intrinsic protein，MIP）蛋白家族，主要参与调控甘油的外排和吸收[21-22]。由图7可知，在进入高渗环境不久，T酵母的FPS1基因的表达量开始上升并且中低盐度条件下FPS1的基因表达量明显高于高盐度水平下的表达量，而16%条件下FPS1的表达水平变化不是很大。进入环境20 min左右，FPS1在T酵母中的表达量达到最大，说明T酵母中的Fps1p蛋白对环境变化产生的影响反应十分迅速，这可能由于Fps1p蛋白位于细胞膜上因此对环境的信号的相应十分迅速。在60 min左右3个盐度下的FPS1基因的表达量就大致相当，说明Fps1p蛋白在整个甘油累积的过程中的前期起着重要作用。

3 结论

甘油是T酵母平衡胞内外渗透压的一种重要的相容性物质，对其有着极其重要的意义。在高渗环境中胞内甘油的合成基本上瞬间启动，随着培养时间的延长，甘油的合成趋于平稳。通过对GPD1和FPS1的表达量变化分析可以得知，T酵母通过加快甘油的合成以及关闭甘油外排通道来共同提高胞内甘油的含量，维持细胞正常的生长。T酵母的耐盐机制十分复杂，其他耐高渗相关基因的变化还需要进一步的分析。

[1]王夫杰，鲁 绯.我国酱油研究现状与发展趋势[J].中国酿造，2010，29（12）：3-7.

[2]冯云子，崔 春，高献礼，等.中式酱油与日式酱油非挥发性成分的比较举[J].食品与发酵工业，2010，36（7）：62-66.

[3]王春玲，刘 卓，綦 伟，等.耐盐酱油酵母产香气成分的动态分析[J].中国酿造，2008，27（9）：16-18.

[4]蔡金星，曹小红，刘秀凤.耐盐酱油酵母生长特性分析[J].中国酿造，2005，24（5）：14-17.

[5]FLOWERS T J,TROKE P F,YEO A R.The mechanism ofsalttolerance in Halophytes[J].Annual Review of Plant Physiology,1977,28:89-121.

[6]MUNNS R,TESTER M.Mechanisms of salinity tolerance[J].Annual Review of Plant Physiology,2008,59:651-681.

[7]BROWN A D.Compatible solutes and extreme water stressing eukaryotic microorganisms[J].Adv Microb Physiol,1978,17:181-242.

[8]SHARMA S C.A possible role oftrehalose in osmotolerance and ethanol tolerance in Saccharomyces cerevisiae[J].FEMS Microbiol Lett,1997, 152:11-15.

[9]LI H H,MENG W,CONG W,et al.Analysis of salt-tolerance genes in Zygosaccharomyces rouxii[J].Appl Biochem Biotech,2013,170(6): 1417-1425.

[10]TIKAM C D,LISA S,PAOLO G.Adaptive response and tolerance to sugar and salt stress in the food yeast Zygosaccharomyces rouxii[J].Int J Food Microbiol,2014,185:140-157.

[11]WEIQ,LIH H,HONGL G.Effectofsalt-tolerantyeastof Candida versatilis and Zygosaccharomyces rouxii on the production of biogenic amines during soy sauce fermentation[J].Int J Food Microbiol,2014, 94(8):1537-1542.

[12]刘传斌，李 宁，白凤武，等.酵母胞内海藻糖微波破细胞提取与传统提取比较[J].大连理工大学学报，2001，41（2）：169-172.

[13]张 岩，梁 萌，刘德华.克鲁氏假丝酵母在高渗环境中海藻糖和胞内甘油积累的研究[J].生物工程学报，2001，17（3）：332-335.

[14]诸葛斌，钱秀梅，方慧英，等.甘油发酵液中甘油含量的快速测定方法[J].食品与发酵工业，2004，30（8）：101-103.

[15]SN/T 2544-2010.甘油含量的测定-高效液相色谱法[S].北京：中国标准出版社，2010.

[16]JINMAIJ,EUN J L,MELISSA G P,et al.High-throughput profiling of mature MicroRNAby real-time PCR[J].RNA Interference Techniques, 2011,58:113-121.

[17]THOMAS D S,KENNETH J L.Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method[J].Nat protoc,2008,3:1101-1108.

[18]KERRY L O,DENISE C,BRUCE R M.A Study of PCR inhibition mechanisms using realtime PCR[J].J Food Sci,2010,55(1):25-33.

[19]HARUO S,KAZUO T.Regulation of the osmoregulatory HOG-MAPK cascade in yeast[J].J Biochem,2004,136:267-272.

[20]GEORG H,STEPHANE G,ELKE N.GPD1 and GPD2 fine-tuning for sustainable reduction ofglycerolformation in Saccharomyces cerevisiae [J].Appl Environ Microbiol,2011,77(17):5857-5867.

[21]LUYTEN K,ALBERTYN J,SKIBBE WF,etal.Fps 1,a yeastmember ofthe MIP family ofchannelproteins,is a facilitator for glyceroluptake and efflux and is inactive underosmotic stress[J].EMBO J,1995,14(7): 1360-1371.

[22]TAMÁS M J,LUYTEN K,SUTHERLAND F C,etal.Fps 1p controls the accumulation and release of the compatible solute glycerol in yeast osmoregulation[J].J Mol Microbiol,1999,31(4):1087-1104.

Preliminary study on osmotolerance mechanism of T yeast on soy sauce brewing flavor

WANG Cong,WANGMeng,HE Jingyu,WANG Chunling,HOU Lihua*

(College of Food Engineering&Biotechnology,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China)

The osmotolerance mechanism of T yeast(Candida versatilis)used in soy sauce fermentation was studied by simulating hypertonic environment.The content of intracellular glycerolin different salinity conditions was dynamically determined by HPLC.Results showed that intracellular glycerol was accumulated rapidly within 20 min and the content with 16%salinity was higher than without salt and 8%salinity.The expression changes of osmotolerance genes was considered by realtime quantitative PCR.The expression changes of GPD1 and FPS1 was identicalto the variation tend of intracellular glycerol,showing that the osmotolerance of C.versatilis due to the rapid glycerol synthesis ability and turn off of efflux channel,which increased intracellularglyceroland ensured yeastgrowth.

T yeast;osmotolerance mechanism;glycerol;realtime quantitative PCR

TS201.3

A

0254-5071（2015）02-0026-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.006

2014年全国调味品行业“安琪酵母抽提物杯”科学技术论文大赛三等奖

2014-11-10

国家自然科学基金（31371819）

王 聪（1990-），男，硕士研究生，研究方向为食品营养与基因组学。

*通讯作者：侯丽华（1976-），女，副教授，博士，研究方向为食品微生物。