超滤在蛋白质纯化中应用进展

梁秋波

哈药集团技术中心

超滤在蛋白质纯化中应用进展

梁秋波

哈药集团技术中心

超滤是一种非常实用的膜分离技术，在生物药研发领域，尤其是对分泌型表达的蛋白或者抗体类进行浓缩，配合亲和层析，离子交换层析或者疏水层析等纯化方法去除内毒素等方面应用非常广泛。本文仅对超滤技术在蛋白质分离纯化和去除内毒素方面的应用进行综述。

超滤；截留分子量；蛋白质；浓差极化

超滤（ultrafiltration，UF）是以压差为驱动力的膜分离技术。即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的压力活性膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质和小分子物质实现了分离。膜分离技术从精度上划分，一般可分为四类：微滤、超滤、纳滤和反渗透，在过滤精度上一次增高。在生物制药工程领域，超滤技术常用来对蛋白质进行纯化或者浓缩，或者配合各种色谱层析方法去除内毒素等方面。

1 超滤的起源

1748年，Schmidt用棉花胶膜过滤溶液，当给溶液施加一定压力时，溶液透过了膜，而溶液中的悬浮物质被截留下来，由于其过滤的精度远远好于滤纸的过滤效果，可以认为是超滤技术的最早应用。1896年，Martin制造了世界上第一张超滤膜。随着人类对微观领域研发的逐步深入，超滤技术在二十世纪90年代以后逐步走向成熟，进入了产业化生产和实际应用阶段。

2 超滤技术在蛋白质纯化方面的应用

在蛋白质纯化过程中，超滤技术主要有去除小分子杂质和蛋白浓缩两大方面的应用。其应用特点就是处理量非常大，最小处理几升，最多可以处理几千升，甚至上万升，并且处理速度非常快，节省大量时间。目的蛋白被有效浓缩，使溶液体积显著减少，目的蛋白回收率高，不仅方便了下游纯化，而且由于超滤使小分子杂质都被过滤掉，减少对纯化树脂的损伤。

徐华民[1]应用超滤技术在提取豌豆分离蛋白生产中的应用进行了研究，探讨了超滤过程的压力、温度、膜材料和膜形式对提取效果的影响作用，采用超滤技术粗蛋白的收率达到85%-90%，效果非常好。

马岚，葛克山，任发政等[2]研究超滤分离酪蛋白糖巨肽的最优工艺参数，已达到最佳超滤通量性能，研究料液pH值、操作压力和温度等对膜渗透通量的影响，利用SDS-PAGE凝胶电泳技术分析超滤截留液的相对分子量分布。结果表明溶液pH值7.0、操作压力0.3MPa、温度45℃时膜渗透通量最高，超滤酪蛋白糖巨肽的截留率达到97.54%，产物纯度达到92.45%，说明超滤技术是将酪蛋白糖巨肽与其他乳清蛋白分离的有效方法。

方希修，王冬梅，管军军等[3]应用平板式膜超滤技术与DEAE离子交换层析法对卵黄免疫球蛋白进行分离纯化，首先将卵黄液经过稀释后，对其进行超滤，并分析各种因素对其的影响，确定截留分子量为100kDa，压力差为0.12MPa，结果截留液体回收率达到91.89%，纯度为86%，最后经过DEAE离子交换层析得到高纯度的抗体。

3 超滤技术在去除内毒素方面的应用

内毒素是一种脂多糖，是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，内毒素单体根据低聚糖链的不同，相对分子质量为10000-20000，常常以聚体的形式存在，分子质量可达到几十万至几百万，选择不同截留分子量的超滤膜或者超滤离心管可以有效去除溶液中的内毒素。

王娟，谢飞，陈潭琇等[4]在使用超滤技术去除纯化后的重组融合蛋白溶液中的内毒素实验中，采用几种不同的离子树脂组合去除内毒素，结合SDS-PAGE分析蛋白纯度，并使用鲎试剂检测内毒素的残留，结果显示，CM或者CM联合疏水层析均不能有效去除内毒素，其中疏水层析对去除内毒素几乎没有效果，而CM加超滤可以有效去除内毒素，可见超滤技术在去除内毒素中发挥了重要作用。

张金龙，李冰，任军等[5]在建立CHO细胞表达的抗炭疽保护性抗原人源化单抗纯化工艺和质量方法建立的试验中，对收货的50L无血清悬浮培养的CHO工程细胞培养液，通过离心去除细胞及碎片后进行超滤浓缩上清液，经过亲和层析，离子交换层析，所得的目的蛋白经G25凝胶柱更换缓冲液后完成纯化，对纯化的产品进行单抗鉴别、相对分子质量、纯度、生物学活性、产品的相关杂质（聚集物和降价产物）、工艺相关杂质（宿主蛋白残留、蛋白A残留）、安全性（凝胶法检测内毒素、薄膜过滤法考察无菌）分析，经检测，样品回收率达61.7%，单抗鉴别阳性、分子质量与预期相符，单体比例为99.25%，二聚体比例为0.75%，EC50值为0.1516μg/m l，宿主蛋白残留，内毒素残留，无菌等均符合药典要求。

综上所述，超滤技术虽然在蛋白质纯化上有广泛的应用，但也有一定的局限性，如超滤膜易污染，浓差极化等问题，蛋白质在膜上的吸附通常是污染和浓差极化的主要原因，而切向流过滤可以有效解决这一问题。随着近些年来生物工程产业的不断发展壮大，对下游纯化技术提出了更高的要求，而传统的单一方法或者几种的方法的组合往往达不到理想的效果，超滤技术由于在蛋白质纯化上的天然优越性，其应用一定会越来越广泛。

[1]徐华民.超滤技术在豌豆分离蛋白生产中的应用[J].粮食与饲料工业,1999(7)：41-42.

[2]马岚,葛克山,任发政等.酪蛋白糖巨肽超滤分离的工艺优化研究[J].食品科学,2008,29(12)：278-281.

[3]方希修,王冬梅,管军军等.超滤/DEAE离子交换层析分离纯化IgY的研究[J].山东畜牧兽医,2009.

[4]王娟,谢飞,陈潭琇等.超滤技术去除重组MUC1-MBP融合蛋白中内毒素的效果评价[J].吉林大学学报,2014,40(3)：539-542.

[5]张金龙,李冰,任军等.CHO细胞表达的抗炭疽保护性抗原人源化单抗的纯化及质量控制分析[J].生物技术通讯,2014,25(6)：817-820.

梁秋波（1973-），男，黑龙江北安人，哈药集团技术中心，硕士研究生，研究方向：重组蛋白和抗体的纯化。