脉冲场凝胶电泳技术在致病菌分型技术的应用

王宇

上海市黄浦区疾病预防控制中心，上海200023

脉冲场凝胶电泳技术在致病菌分型技术的应用

王宇

上海市黄浦区疾病预防控制中心，上海200023

脉冲场凝胶电泳(pulse-field gelelectrophoresis，PFGE)，又称脉冲式交变电场电泳，该技术是将电泳电场方向交替性改变，并优化脉冲时间和其他条件，可以分辨凝胶中35～10 000 kb的DNA分子。该方法应用于分子流行病学中，通过观察电泳条带的差异，为确定菌株之间的亲缘关系提供了可靠的技术手段。该技术在致病菌溯源（细菌性传染性疾病溯源、细菌性食源性疾病溯源）、医院内感染流行监测等方面都有广泛的应用。

脉冲场凝胶电泳；致病菌分型；致病菌溯源；院感监测

脉冲场凝胶电泳(pulse-fieldgelelectrophoresis，PFGE)，又称脉冲式交变电场电泳，是上世纪80年代后期发展起来的一种新型的电泳技术，主要用来分离大分子量线性DNA。传统的琼脂糖凝胶电泳技术仅能分离50 kb以下的DNA分子，对于超过50 kb的DNA分子，传统的琼脂糖凝胶其分子筛作用较弱，无法清晰分辨电泳条带[3]。脉冲场凝胶电泳技术突破了该瓶颈，很好地解决了这一问题。1984年，Schwartz和Cantor首次将脉冲场凝胶技术应用于染色体DNA的分离，并成功分离到16条完整的酿酒酵母菌细胞染色体DNA。此后该技术得到了长足的发展，到目前为止，PFGE技术已经可以分离高达10 Mb级DNA分子[4]。

PFGE技术因其所具备的高分辨能力，其应用范围不断扩大，几乎覆盖所有生物基因组结构的研究。国内开始应用脉冲电场凝胶电泳技术最早应用于研究鼠疫耶尔森菌[5]，可见脉冲电场凝胶电泳技术在致病菌分型上有其独特的优势，适于推广应用。近年来，该技术不断成熟，特别是限制性内切酶的应用，使其成功应用于菌株亲缘关系的分析。通过对检测仪器、试剂、操作程序进行标准化设置，可以建立一套重复性好、分辨率高且数据可以共享的细菌分子分型方法，该方法已在流行病学调查和院内感染分析中起到日益重要的作用。

1 PFGE在致病菌检测方面的应用原理

细菌以二分裂方式进行增殖，在其不断的传代过程中，其亲缘细菌之间具有相同的基因物质。不同来源的致病菌中的基因物质是否相似是鉴定其是否具有亲缘关系的依据[6]。使用适宜的限制性内切酶，可以在4 h内将基因组DNA酶切成10～20个DNA大限制性片段，通过对这些片段的大小和数量进行分析可以对DNA大分子进行鉴定[7]。在正电场推动下，琼脂糖(或聚丙烯酰胺)凝胶以筛滤形式对大小不同的DNA分子起分离作用。DNA

分子可看作自由牵引的卷体，只有在整个分子沿一系列胶孔运行时，DNA的泳动方能实现。较小的DNA分子可进入较小的胶孔，大些的DNA分子只能进入较大的胶孔，故需较长时间才能找到可进入的胶孔，因而泳动轨迹弯曲，泳动速度慢。＞30 kb的DNA分子在电泳时只能以头尾牵引方式进入胶孔，如同蛇行一般，凝胶滤过效应不再起作用，从而也无法分离DNA。虽然通过降低凝胶浓度和电场强度可在一定程度上解决较大DNA分子的分离困难，但仍然无法解决大于150 kbDNA分子的分离。PFGE技术与传统电泳技术的最大区别就是其电泳电场可定期改变，且电场改变的方向和时间均可根据不同大小的DNA分子进行优化。当电场方向改变时，不同大小的DNA分子重定向的时间与其分子大小成正比，随着电场定期交替变化，不同大小的DNA分子以不同速度在凝胶上以蛇形轨迹泳动，从而达到分离大分子DNA片段的目的。通过对电场方向、脉冲时间、凝胶浓度等条件的优化，可以有效分离35～10 Mb的DNA大分子[1]。

2 PFGE在致病菌方面的应用

2.1 致病菌溯源

常规的诊断方法是根据微生物的表型特征而进行的，例如根据微生物对不同染料的染色性、生化反应和血清学反应、抗原特性、药敏实验、菌落特征、是否携带噬菌体、是否表达细菌素以及菌体蛋白成分等综合指标进行判定，这些方法存在的一个共同问题是，许多情况下只能鉴定某一类病原微生物，属于特异性诊断方法。病原微生物的生理、生化表型是由其所含的遗传物质决定的。表型的差异是遗传物质结构差异的体现。直接研究细菌染色体DNA分子的特点，比较各种细菌DNA组成和结构的差异与相似性，可从本质上阐明细菌间的差别及亲缘关系[2]。

2.1.1 细菌性传染性疾病溯源传染性疾病是严重危害人类健康的一类疾病。人类在自然科学领域已经取得许多令人瞩目的成就，但在与传染性疾病的抗争中，仍没有完全掌握这类疾病发生的机理。在细菌性疾病方面，早期快速诊断和对菌株的鉴定是临床实验室一直努力的目标。对各种病原微生物建立快速的诊断和检测方法是采取有效治疗和应对措施的重要前提。当对一个未知的病原微生物采用某一特定的检测方法进行检测而未能得到预期结果时，容易造成治疗上的延误，尤其在公共突发性生物事件急需尽快做出准确结论时，延误将带来较大的经济和生命的损失。而PFGE可从本质上阐明细菌间的差别及亲缘关系，从而快速找到应对方法及传染源，为研制疫苗等防治提供有效信息，保护人群健康，减少经济损失，避免人群恐慌。

如江西省疾病预防控制中心的熊长辉医生等利用脉冲场凝胶电泳技术分析流行性脑脊髓膜炎（简称“流脑”）病例及其密切接触者分离出的脑膜炎奈瑟菌（Nm）的同源性以及不同病例分离出Nm的相关性。他们对6例疑似流脑病例的血液和脑脊液标本以及对密切接触者咽拭子进行脑膜炎奈瑟菌的培养分离,分离菌进行氧化酶试验、血清学分群鉴定、糖原利用试验和脉冲场凝胶电泳（PFGE）鉴定试验.结果6例疑似流脑病例与其密切接触者共分离出21株菌,均为Nm C群,5株为AH 1型,14株为AH 2型,2株为AH 47型。结论，流脑病例分离出的Nm与其密切接触者分离出的Nm完全同源,其中4例病例病原菌来自同一菌株[8]。

2.1.2 细菌性食源性疾病溯源目前，在世界范围内，细菌性食源性疾病仍然是人类面临的一个严重的问题。特别是交通、物流、旅游行业的快速发展，细菌性食源性疾病的发病模式也有了较大的改变。以往，食源性疾病多以单一地区的集中爆发为主，现在食源性疾病更多以多地爆发或者表现为多地表面上的“散发”。因此，在食源性疾病爆发或者“潜在”爆发的时候，应对不同来源的病原体分子水平和基因物质的水平上进行鉴定以确定其亲缘关系，并对具有同源性或亲缘关系相近的致病菌开展流行病学调查，确定传播途径并追踪传染源[7]。

由于PFGE技术可以在分子水平上评估不同来源细菌的亲缘关系，因此，在细菌性食源性疾病的溯源调查过程中，PFGE技术被广泛应用于判定可疑食品分离菌株、污染环境中分离菌株、病人呕吐物或排泄物中分离菌株以及可疑传染源分离菌株的同源性或亲缘关系，成为细菌性食源性疾病溯源判定的金标准[9-10]。目前，多个发达国家都建立了基于PFGE技术的细菌分子分型网络实验室，用于食源性疾病的防控。不同地区的网络实验室通过共享PFGE图谱数据库，可以对不同来源菌株进行同源性即时比对，从而发现潜在的食物中毒事件，做

到早发现、早预警，以便更即时的采取公共卫生干预行动。

如浙江省宁波市传染病院的的王春萍医生、金春光医生在2009年对来自食物中毒标本中分离的沙门菌进行分子分型。经菌株分离、生化鉴定和血清型确定参照GB4789.4-2003方法进行,对5株布利丹沙门菌用PFGE方法进行分子分型,应用Quantity oneTM分析软件对电泳后的条带进行分析。结果：从7份标本中检出5株布利丹沙门菌,检出率为71.4%,经PFGE分型,5株来源于食物中毒病人标本的布利丹沙门菌其带型一致,因此PFGE型别相同[11]。

美国于1998年5月建立PulseNet（病原菌分子分型监测网络），是最早将PFGE技术应用于食源性疾病监测以及快速反应和预警的国家，并有多起成功案例。在一起多州发生的食物中毒事件中，PulseNet通过比对数据库，发现多株致病菌具有相同的PFGE图谱，CDC经过流行病学调查，最终确定多起可疑食物均来自于一家墨西哥农场，通过对该农场生产食物的控制和处理以及该农场卫生状况的改善，从而在源头上控制了该起食物中毒的爆发[7]。

2.2 在医院内感染流行监测方面的应用

引起院内感染暴发的微生物具有克隆相关性，即它们拥有相同的起源。克隆相关菌株具有相同的毒力、生化特性和基因相似性特征。由于微生物在种属水平上存在着变异，分离自不同时间、不同地点、不同部位的细菌常被分为不同的型或亚型。分型对于鉴别感染流行、鉴定交叉感染、确定感染来源、识别特殊毒力株、指导实施免疫计划有着非常重要的意义。将PFGE用于细菌感染流行病学研究，可以分析细菌较大的基因组DNA片段，能将整个细菌基因组的酶切片段图谱清楚地显现于一块凝胶上，且重复性极好，具有很高的特异性和分辨力，能够较好反映流行病学相关性，是公认的医院感染调查最好的分型方法，它能有效地协助查清感染来源，发现流行传播方式，及时有效地控制流行，指导临床治疗，是一种快速、可靠、准确的院内感染细菌的流行病学调查方法[12-14]。

如上海复旦大学附属中山医院呼吸科的陈海红医生等对医院2007—2008年以及2005年上半年下呼吸道标本分离的耐碳青霉烯类抗菌药物鲍曼不动杆菌（CRAB）复活后，采用脉冲场凝胶电泳技术进行基因同源性分析。其PFGE图谱分析发现,2007—2008年所复活的63株细菌中共有A、C-L等11种基因型,主要为流行株C和流行株E,各有20株,各占31.7%；此时期,外科重症监护病房（SICU）分离的25株CRAB主要来源于流行株C（72.0%）,该病区中流行株C最早分离于2007年12月,之后在2008年引起持续而频繁的感染；急诊重症监护病房（EICU）分离的细菌以流行株G1为主（40.0%）,呼吸科病房及留院观察室均以克隆株E为主；SICU 2005年2—6月分离的CRAB有A和B两种基因型,以流行株B为主,占80.0%；克隆株A首次分离于2005年2月的SICU的痰标本,之后（2007—2008年）在所研究的各个病区间断出现。结论近两年医院CRAB主要的PFGE基因型为流行株C和流行株E,克隆株G1和克隆株E可引起暴发流行；同一克隆株可在同一病房内发生交叉感染从而引起流行暴发；流行相关的克隆株可在病区长期生存,从而引起病区内持续感染,需要积极采取感染控制措施；与2005年相比,近两年SICU中的主要流行株由克隆株B变为克隆株C,推测同一个病区的流行基因型可能存在流行变迁[15]。

3 PFGE方法的局限性

虽然PFGE方法得到了广泛的应用，但其自身也存在着一些不足之处。比如仪器设备、耗材以及数据库分析软件价格昂贵，不利于推广；实验步骤繁琐，技术不易掌握；实验耗时较长（2～4 d），错过流行学调查最佳时机。由于PFGE方法是对限制性内切酶酶切片段条带的带型进行区分，其分辨力和精确性不足，可能会导致某些流行病学上无相关的菌属间由于具备相同的内切酶位点而表现出相同的PFGE图谱[3]，相对于随机扩增多态性DNA技术（RAPD）、重复序列PCR技术（Rep-PCR）、多位点序列分型技术（MLST）、IS200分型等方法，还存在一些局限性[16-17]。尽管该技术还存在着一定的不足之处，目前其在细菌分子分型领域仍然是最推崇的方法之一。

自1984年脉冲场凝胶电泳技术问世以来，这项技术经过不断的完善，得到了越来越广泛的应用。为病原微生物致病机制、分子流行病学和基础科学等领域的发展做出了巨大的贡献，也将会在未来的研究中得到更好的加强，在技术和成本上不断更新进步，使其更好地应用于相关的研究领域。

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Pulsed-field Gel Electrophoresis and its Application in Pathogen Molecular Typing

WANG Yu
Huangpu District Centre for Disease Control and Prevention，Shanghai，200023 China

Pulsed Field Gel Electrophoresis(PFGE)is a new technique of gelelectrophoresis developed in1980's.It can be used to separate large DNA molecules ranging from 35 to10 Mb.It has been widely applied to the pathogen molecular typing,identification of species groups，Source-tracking of pathogen and nosocomial infection surveillance.

PFGE；Pathogen molecular typing；Traceability pathogens；Hospital infection surveillance

R378

A

1672-5654（2015）08（b）-0186-04

10.16659/j.cnki.1672-5654.2015.23.186

2015-05-17）

上海市黄浦区科委课题（2011HGG-09）。

王宇（1973.3-），男，回族，辽宁辽阳人，硕士，副主任技师，从事微生物检验相关研究。