磺胺氯吡嗪钠单克隆抗体的制备及鉴定

张 梦，刘迎春，蒋 蔚，陈永军，张花景，薛俊欣,2，宫枫举,2，曾 鹏,2，王民燕，王 权

（1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；2.南京农业大学动物医学院，南京 210095）

·研究论文·

磺胺氯吡嗪钠单克隆抗体的制备及鉴定

张 梦1，刘迎春1，蒋 蔚1，陈永军1，张花景1，薛俊欣1,2，宫枫举1,2，曾 鹏1,2，王民燕1，王 权1

（1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；2.南京农业大学动物医学院，南京 210095）

应用重氮化方法制备了磺胺氯吡嗪钠（sulfachloropyrazine sodium, SPZ）完全抗原SPZ-OVA，将成功偶联的人工全抗原（SPZ-OVA）免疫BALB/c小鼠，免疫4次后，经间接ELISA检测，1号小鼠血清抗体效价达到1 : 6.4×104。取该小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。利用ELISA方法对融合后的杂交瘤细胞上清进行检测，筛选出能够稳定分泌抗体的细胞株：D9。将细胞株D9扩大培养后，经腹腔注射小鼠使其产生腹水。腹水单抗经纯化后，通过间接竞争ELISA对该单克隆抗体的效价、半数抑制浓度以及特异性进行检测。结果表明，所制备的单克隆抗体效价为1 : 4×105，半数抑制浓度为326 ng/mL，特异性良好。

磺胺氯吡嗪钠；单克隆抗体；间接竞争ELISA

磺胺类药物（sulfonamides，SAs）具有对氨基苯磺酸结构，该类药物抗菌谱广，因其价格低廉、使用方便在动物养殖中被广泛使用[1]。其中磺胺氯吡嗪钠 (sulfachloropyrazine sodium，SPZ) 具有在动物体内作用持续时间长，且不影响宿主对球虫的免疫力等特点，从而被用于治疗家禽球虫病[2]。有研究表明SPZ也可抑制弓形虫速殖子的繁殖[3]。然而磺胺类药物作为饲料添加剂，却往往导致多种细菌产生抗药性，威胁人类健康[4]。为此，亚洲和欧美等多个国家规定了动物性食品中磺胺类药物的最高残留限量（maximum residue limit, MRL）为0.1 mg/ kg[5]，我国规定动物源性食品中磺胺类药物的MRL为0.05～0.1 mg/kg[6]。

目前，磺胺类药物残留检测常采用气相色谱法[7,8]、液相色谱法[9,10]、液相色谱-串联质谱法[11]等。与理化检测方法相比，免疫学方法具有特异性强、操作简单、灵敏度高的特点，因此，本研究拟制备磺胺氯吡嗪钠的单克隆抗体，在此基础上建立间接竞争ELISA（indirect copetitive ELISA，ci-ELISA）方法，为该药残留检测提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂BALB/c小鼠，昆明系小鼠购于上海斯莱克实验动物有限公司；磺胺氯吡嗪钠（含量99.97%，批号：091001）、磺胺嘧啶钠（含量99.53%，批号：091001）、磺胺对甲氧基嘧啶钠（含量99.23%，批号：090803）、磺胺氯哒嗪钠（含量99.81%，批号：20091101）、磺胺甲氧哒嗪钠（含量99.50%，批号：20091101）和磺胺二甲嘧啶钠（含量99.55%，批号：090911）购于上海宝山振宗生物工程厂；40%PEG、牛血清蛋白（BSA）和卵白蛋白(OVA) 购于美国Sigma公司；NaNO2和盐酸购于国药集团上海化学试剂公司；小鼠骨髓瘤细胞SP2/0为本实验室保存。

1.2 磺胺氯吡嗪钠（SPZ）免疫原的制备及鉴定

1.2.1 磺胺氯吡嗪钠（SPZ）完全抗原SPZ-OVA及包被原SPZ-BSA的制备 通过重氮化方法制备其免疫原及包被原。首先对SPZ进行重氮化反应：称取SPZ 10 mg，用少量蒸馏水溶解，在4℃条件下同时缓慢滴加预冷的盐酸（0.1 mol/L）和NaNO2水溶液（10 g/L），并用淀粉碘化钾试纸实时监测，试纸刚变蓝时停止滴加反应液，4℃避光反应10 min。

取25 mg的OVA溶于1 mL的碳酸盐缓冲溶液（pH 9.6，0.2 mol/L）中，离心后取上清，在4℃条件下，逐滴加入NaOH（1 mol/L）和重氮化的SPZ溶液，并持续搅拌，保证反应体系的pH值在10左右。4℃避光反应过夜，然后用PBS（pH 7.4）透析，每天更换透析液3次，透析3 d。将制备的SPZ-OVA分装、标记，-20℃保存。

包被抗原（SPZ-BSA）的制备，用BSA替代OVA，其他操作同上。

1.2.2 完全抗原鉴定 把透析好的免疫原SPZ-OVA和载体蛋白OVA用PBS配制成200 ng/mL溶液，将药物SPZ用PBS配制成50 μg/mL溶液，用紫外分光光度计分别进行紫外扫描，通过比较药物和偶联物的紫外图谱对偶联结果进行验证。

1.3 单克隆抗体制备

1.3.1 小鼠免疫 取8周龄BALB/c小鼠2只，将SPZ-OVA用弗氏完全佐剂乳化后，足垫注射小鼠进行首次免疫，剂量为200 μg/只。随后每2周对小鼠加强免疫1次，用与首次免疫等剂量抗原和弗氏不完全佐剂乳化后，皮下多点注射免疫。细胞融合前3 d，小鼠腹腔直接注射SPZ-OVA，250 μg/只，进行1次加强免疫。

1.3.2 细胞融合及培养 细胞融合时取对数生长期小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）和免疫小鼠的脾细胞，以10:1的比例混合置于融合管中，在45 s内加入1 mL预热的PEG，作用90 s后，加入30～40 mL预热的不完全DMEM培养基，终止反应。在37℃培养箱中静置10 min后离心，弃上清后用含20% 胎牛血清（FBS）的HAT完全培养基重悬细胞，将融合细胞悬液滴加到铺有小鼠腹腔巨噬细胞的96孔板中，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。融合后注意观察细胞生长情况，融合后d7补加HAT培养基，观察融合细胞生长状况。约10～15 d后，待杂交瘤细胞布满孔底约1/5面积时，吸取细胞上清供抗体检测。1.3.3 杂交瘤细胞的初步筛选 镜检观察培养孔中细胞克隆生长情况，对孔中细胞克隆不超过3个的进行标记，吸取细胞上清，然后通过间接ELISA测定抗体分泌情况。具体步骤：以0.5 μg/mL SPZ-BSA

包被酶标板，4℃过夜，用PBST（0.05% Tween-20 PBS溶液）洗涤3～4次，每次3 min，然后加200 μL明胶（10 g/L），37℃ 封闭3 h，同上洗涤。加入待测细胞上清10 μL，用抗体稀释液（含5% 小牛血清的PBST）补液至100 μL，阴性对照加100 μL抗体稀释液，37 ℃孵育1.5 h，同上洗涤。每孔加入100 μL 按1:2000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育1.5 h，同上洗涤。每孔加入100 μL新配制TMP底物显色液，37℃避光反应10～15 min，然后加入50 μL硫酸溶液（2 mol/L）终止反应，测量OD450值，P/N≥2.1为阳性。

从阳性克隆中去除其分泌抗体对蛋白载体有反应的克隆，分别以SPZ-OVA、BSA和OVA包被，对阳性克隆再次筛选，将仅对SPZ-BSA显色的孔判为阳性。

1.3.4 对细胞阳性克隆进行亚克隆及药物竞争抑制筛选 对上述阳性细胞克隆挑选OD450值高且生长状态好的阳性克隆按有限稀释法进行亚克隆，同时用ci-ELISA进行第三次筛选，步骤如下：以0.025 μg/ mL SPZ-BSA包被过夜，37℃封闭酶标板。取阳性细胞上清2 μL用1 mL抗体稀释液稀释，称取一定量SPZ用PBS稀释成1000、500 、0 ng/mL的SPZ标准溶液，在反应孔中依次加入不同浓度SPZ标准溶液和稀释的细胞上清各50 μL，其余操作同间接ELISA，得到各反应孔OD450值并计算抑制率。将筛选出的抑制率高的细胞株按有限稀释法继续进行亚克隆，经多次亚克隆，待细胞上清阳性率为100%时，建株并对细胞扩大培养，液氮保存。

1.3.5 腹水单克隆抗体的制备 取8周龄BALB/c雌性小鼠提前3周腹腔注射石蜡油，每周1次，0.5 mL/只。将扩大培养的杂交瘤细胞用葡萄糖生理盐水重悬，于第4周腹腔接种小鼠，约106个细胞/只。接种后每天观察小鼠状态，约10 d后可观察到小鼠精神萎靡，腹部膨大。待小鼠濒死不动时用针头收集腹水，离心取上清，－70 ℃保存备用。

1.4 单抗型及亚型鉴定用SouthernBiotech亚型鉴定试剂盒鉴定腹水单抗亚型。按试剂盒说明书操作。

1.5 单抗（MAb）特性分析

1.5.1 MAb的IC50的确定 首先用棋盘法筛选出最适包被原浓度（0.01 μg/mL）和抗体稀释倍数大致范围，进一步用间接ELISA确定抗体稀释倍数，在此基础上建立间接竞争ELISA（ci-ELISA）。具体步骤：用SPZ-BSA 0.01 μg/mL包被酶标板，4℃包被过夜，37℃封闭。用PBS稀释SPZ标准品，浓度依次为4000、2000、1000、500、200、100、20、0 ng/mL，取上述液体各50 μL，加最适浓度的单抗50 μL，其余步骤同1.3.3。同样浓度做3个重复，取平均值绘制曲线，计算SPZ半数抑制质量浓度IC50。

1.5.2 MAb特异性分析 用ci-ELISA的方法检测MAb与其他磺胺药物的交叉反应。称取一定量的磺胺氯吡嗪钠（SPZ）、磺胺嘧啶钠（SD）、磺胺对甲氧基嘧啶钠（SMDZ）、磺胺氯哒嗪钠（SCP）、磺胺甲氧哒嗪钠（SMX）和磺胺二甲嘧啶钠（SM2），用PBS稀释成不同浓度的溶液，进行ci-ELISA测试。根据拟合线性曲线方程，计算各药物IC50，然后计算药物交叉反应率（CR）。

交叉反应率= （产生50%抑制时SPZ的浓度/产生50%抑制时其他药物的浓度）×100%。

2 结果

2.1 人工抗原紫外扫描将SPZ-OVA、SPZ和OVA溶液进行紫外扫描。SPZ 在256 nm和330 nm处有两个吸收峰，OVA在278 nm处有吸收峰，偶联物除256 nm和330 nm两处吸收峰外，在380～400 nm有吸收峰，为新生成的偶氮基团的吸收峰，初步证明药物偶联成功。

2.2 阳性杂交瘤细胞筛选结果细胞融合后，从阳性克隆中挑选出分泌抗体仅针对SPZ-BSA且OD值高的11株杂交瘤细胞，进行2～4次亚克隆，用ci-ELISA进行竞争抑制筛选，从中筛选抑制率高的5株细胞（表1）。对其多次传代并检测，得到3株稳定分泌SPZ抗体的杂交瘤细胞株，分别为F7C10、F10D9和E11C8。将这3株细胞扩大培养腹腔接种小鼠，收集腹水。对腹水单抗检测，挑选出高特异性的抗体F10D9，简称D9，来进行抗体特性的鉴定。

2.3 MAb亚类分型腹水单抗MAb D9能和羊抗鼠IgM-HRP结合显色，所以MAb类型为IgM，轻链类型为κ（表2）。

2.4 MAb特性鉴定

2.4.1 MAb IC50的确定

2.4.1.1 MAb最佳稀释倍数确定 在最佳包被原浓度下，将腹水单抗梯度稀释，用间接ELISA确定单抗最佳工作浓度。当包被原的浓度为0.01 μg/mL时，对应的MAb D9工作浓度为1:4×105。

2.4.1.2 ci-ELISA标准曲线的建立 在最佳包被原浓度（0.01 μg/mL）和抗体工作浓度（1:4×105）的基础上建立ci-ELISA，对系列浓度稀释的SPZ用 ci-ELISA进行测定，以SPZ空白对照孔OD450值为B0，不同浓度的SPZ竞争反应孔OD450值为B，以B/B0值为纵坐标，SPZ质量浓度（ng/mL）的对数值为横坐标，绘制标准曲线。SPZ在20～4000 ng/mL范围内，B/B0值与SPZ浓度的对数值呈线性关系，方程为y=-0.3369x+1.347，R2=0.994， IC50=326 ng/ mL。

2.4.2 MAb特异性鉴定 MAb D9与磺胺甲氧哒嗪（SMX）无交叉反应（CR＜0.01%），而与其余供试药品有较弱交叉反应（CR＜10%）（表3）。

3 讨论

磺胺类药物具有抗菌谱广、价格低廉、使用方便等特点，因而在畜禽生产中广泛应用，而药物的不规范使用或过量使用会造成动物性食品中药物残留，引起系列人类健康问题，如产生耐药性、过敏或毒性反应[12]。因此，食源性产品中磺胺药物残留的检测具有必要性。

目前检测磺胺氯吡嗪钠主要采用仪器联用技术，如液质联用LC-MS/MS、气质联用（GC-MS）法、薄层色谱分析法等，灵敏度可满足检测要求，其中LC-MC 的最低检测限（LOD）可达到650 ng/ kg[12]。与理化分析技术相比免疫学检测具有高灵敏度和易操作的特点，在药物残留检测方面具有广阔应用前景。本研究以制备的单抗McAb D9 建立的ELISA方法，线性范围在20～4000 ng/mL之间。尽管我国对磺胺氯吡嗪钠最大残留限量没有具体规定，但明确规定磺胺类药总残留最大残留限量为0.1 mg/kg (相当于100 ng/mL)。因而，本研究建立的ELISA对于磺胺氯吡嗪钠超标残留阳性样本可进行有效检测，但灵敏度有待提高，可用化学发光免疫分析技术(CLIA）建立更高灵敏度的检测方法[13]。

药物小分子没有免疫原性，SPZ通过和载体蛋白偶联形成完全抗原，才能激发宿主产生相应抗体。本研究制备的SPZ-OVA免疫小鼠后，小鼠可产生特异性抗体，其效价可达到1:6.4×104，证明合成的人工抗原具有良好的免疫原性。McAb D9对SPZ IC50值为326 ng/mL，与文献[14]报道的SPZ单克隆抗体的IC50类似。由McAb D9的交叉反应实验可知，所制备的抗体对SPZ的特异性比较强，与其他磺胺药有较弱或无交叉反应。本研究对磺胺母核的氨基用重氮化方法以-N=N-与OVA相联，因氨基可能是磺胺母核的重要抗原表位，以SPZ的氨基为偶联基团的抗原制备的抗体，因失去重要表位而对具有磺胺母核的其他磺胺药几乎没有交叉反应，也可能因为SPZ以磺胺母核端与蛋白载体相连，不能在抗原分子表面突出磺胺母核而被免疫活性细胞最大限度地识别所致。为此，若研制检测磺胺类药的试剂盒，可考虑以磺胺母核为基础设计半抗原，并设法突出于抗原表面，研制类特异性抗体，这种研究思路已有研究表明是可行的[15]。

本研究采用有限稀释法[16]进行融合细胞的亚克隆化，即将待克隆的细胞团在显微镜下标记，用移液枪将细胞吸出，置于96孔细胞板中稀释，在显微镜下计数，选取细胞数约为100个/孔，将该孔细胞加至10 mL培养基中，充分混匀后加至铺有饲养细胞的96孔板中进行培养。采用这种方法单克隆率比较高，同时缩短了亚克隆的周期，简单有效。本研究通过对杂交瘤细胞进行筛选后得到的单克隆抗体的效价和特异性对比免疫血清多抗都有了很大提高。

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GENERATION OF A MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST SULFACHLOROPYRAZINE SODIUM

ZHANG Meng1, LIU Ying-chun1, JIANG Wei1, CHEN Yong-jun1, ZHANG Hua-jing1, XUE Jun-xin1,2, GONG Feng-ju1,2, ZENG Peng1,2, WANG Min-yan1, WANG Quan1
(1.Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2.College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

In this study, sulfachloropyrazine sodium (SPZ) was conjugated with ovalbumin (OVA) for preparation of immune antigen through diazotization method. The artif cial antigen (SPZ-OVA) was used to immunize BALB/c mice. After fourth immunization, mouse serum samples were collected and antibodies were titrated to be 1:6.4×104in indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The mouse with higher titer was sacrif ced and spleen was collected for hybridoma production. The hybridoma cells were screened for antibody production in ELISA. One positive hybridomas D9 was obtained and subcloned by limited dilution. A stable antibody-producing clone was then identif ed and propagated. The mouse ascites containing monoclonal antibodies were produced and tested for ELISA titer and half inhibition concentration (IC50). As a fact, the MAb D9 had ELISA titer at 1:4×105and half inhibition concentration (IC50) at 326 ng/mL.

Sulfachloropyrazine sodium; monoclonal antibody; indirect competitive ELISA

S859.795

A

1674-6422（2015）03-0036-06

2015-03-23

上海市技术标准专项 (13DZ0502701)

张梦，女，硕士研究生，预防兽医学专业

王权，E-mail：wangquan@shvri.ac.cn