猪伪狂犬病毒变异株单克隆抗体的制备与鉴定

刘 飞，童 武，杨 莘，郑 浩，李国新，梁 超，田 青，童光志

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）

·研究论文·

猪伪狂犬病毒变异株单克隆抗体的制备与鉴定

刘 飞，童 武，杨 莘，郑 浩，李国新，梁 超，田 青，童光志

为制备猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus, PRV）变异毒株的单抗，以纯化灭活的PRV JS-2012毒株免疫BALB/c 雌性小鼠。经间接免疫荧光法（indirect immunof uorescence assay, IFA)筛选，获得2 株稳定分泌PRV 单抗的杂交瘤细胞：4D8、4F10。2株单抗经亚型鉴定均为IgG1亚类，轻链为κ链，腹水IFA效价均达1:51 200；IFA与IHC结果显示，二者均能与PRV毒株发生特异性反应；Western blot结果表明，4D8与PRV反应条带大小约为60 kDa，而4F10不与PRV发生反应，推测其可能针对PRV的构象性抗原表位。该单抗的制备对PRV的抗原变异及诊断研究均有重要意义。

伪狂犬病毒；单克隆抗体；间接免疫荧光检测；免疫组化鉴定

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）

伪狂 犬 病（Pseudorabies，PR） 是 由 疱 疹病毒科（Herpesviridae）、α疱疹病毒亚科（Alphaherpesvirinae）的伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV） 引起的一种能够使多种家畜及野生动物共患的接触性、急性传染病。PRV感染有发病迅速，嗜神经性和潜伏感染特性[1]。猪是自然宿主[2]，仔猪具有较高的发病率和死亡率。PRV感染主要引起哺乳仔猪发热、食欲不振、呕吐、腹泻、神经症状，

妊娠母猪则表现为流产、死胎等繁殖障碍[3]。2011年以来，PRV变异毒株开始流行，原有疫苗不能对其完全保护，给我国养猪业造成了严重的经济损失[4-7]。本研究将实验室分离的PRV JS-2012流行毒株，进行纯化灭活后免疫小鼠，筛选能稳定分泌PRV抗体的阳性杂交瘤细胞，为抗原变异及诊断研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 细胞、毒株与实验动物PK-15、Marc-145、Vero及SP2/0等细胞株，PRV变异毒株(JS-2012)和弱毒疫苗株(Bartha-K61)，猪繁殖与呼吸综合征 病 毒(Highly pathogenic Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，HP-PRRSV)，猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）及猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）均为本实验室保存；BALB/c小鼠购自上海斯莱克实验动物中心。

1.2 主要试剂PCR试剂购自大连宝生物有限公司（TaKaRa）；DNA提取试剂盒购自上海华舜科技有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）和DMEM 培养基购自Gibco公司；Alexa Fluor® 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody购自Invitrogen公司；次黄嘌呤胸腺嘧啶（HT）、次黄嘌呤氨基蝶呤胸腺嘧啶（HAT）、聚乙二醇PEG均购自Sigma公司；吡咯（BEI）购自TCI公司；Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit购自Bio-Rad。

1.3 PRV纯化与灭活将PRV JS-2012病毒接种单层PK细胞，当细胞达到80%CPE（细胞病变效应，cytopathic effect）时，-80℃冻存，将总量约200 mL病毒液进行差速离心，首先2000×g、4℃离心30 mim，去除细胞碎片与杂质，10 000×g离心30 min，用适量PBS轻悬沉淀后，蔗糖密度梯度离心，（蔗糖梯度：底层60%蔗糖3 mL+上层30%蔗糖7 mL+病毒液1.5 mL），4℃、30 000×g离心3 h，小心用穿刺针抽出病毒层，PBS溶解病毒离心去蔗糖，适量PBS溶解病毒。吡咯（BEI）灭活病毒，灭活完全后备用。

1.4 PRV免疫取适量的纯化病毒，提取DNA，gB特异引物进行PCR鉴定，鉴定后用Nanodrop 2000

测定蛋白浓度。病毒与弗氏完全佐剂等体积混合充分乳化，免疫8周龄雌性BALB/c小鼠，100 μg/只。间隔2周，病毒与弗氏不完全佐剂乳化，进行第2及第3次免疫。3免后2周利用间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence assay，IFA）检测效价，进行细胞融合，方法参照参考文献[8-10]。

1.5 阳性杂交瘤细胞株的筛选用选择性培养基HAT重悬融合细胞，加入到前1 d制备的饲养层细胞中，于37 ℃、5% CO2培养箱进行培养，d5用HAT半换液。观察待克隆细胞长到一定数量时，用感染JS-2012病毒的PK细胞，利用IFA检测有融合细胞孔中的上清液，对检测到的阳性细胞孔，进行有限稀释法筛选。连续进行4次亚克隆，直至得到能稳定分泌特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞株，然后对该杂交瘤细胞株进行扩大培养并冻存。

1.6 MAb的亚型鉴定用Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit按说明书操作进行鉴定，取制备的MAb细胞上清液150 μL加入冻干微粒管中，将试纸条放入其中10 min，观察条带位置。

1.7 MAb的特异性及交叉反应性 PRV JS-2012、Bartha-K61毒株及HP-PRRSV、CSFV和PEDV感染细胞固定后，以MAb细胞上清液为一抗，以山羊抗小鼠IgG (H+L)(1:1000稀释)作为二抗，利用IFA方法检测MAb的特异性和交叉反应性。

1.8 MAb的免疫组化鉴定（immunohistochemical，IHC）将感染PRV和未感染PRV的猪脑组织样本进行取样、固定、包埋、切片、固定。利用EnVision™ Detection Systems Peroxidase/DAB, Rabbit/ Mouse试剂盒（Dako，Denmark）进行鉴定，MAb细胞上清作为一抗，HRP标记的羊抗小鼠IgG作为二抗，经DAB显色，苏木素复染细胞核（由武汉谷歌生物科技有限公司完成），载玻片于显微镜下观察并拍照。

1.9 MAb的Western blot鉴定将收取的107TCID50/ mL的病毒液，经SDS-PAGE电泳后，转至硝酸纤维素（NC）膜上，经5 %脱脂乳封闭，MAb细胞上清作为一抗，4℃过夜，HRP山羊抗小鼠IgG（1:6 000稀释）作为二抗，NC膜经曝光后显影，定影，扫描保存图片。

1.10 腹水制备及效价测定将降植烷以200 μL/只腹腔注射10周龄的BALB/c 小鼠，7 d 后将杂交瘤细胞腹腔注射小鼠（1 ×106个/只），待小鼠腹腔明显胀大时取腹水，离心取上清液即为MAb腹水。腹水倍比稀释至1:51 200倍进行IFA效价测定。

2 结果

2.1 阳性杂交瘤细胞株的筛选将纯化鉴定后的PRV JS-2012株全病毒免疫小鼠，取其脾细胞与SP2/0融合，亚克隆。利用IFA筛选，获得2株能稳定分泌抗PRV MAb的杂交瘤细胞株，命名为4D8和4F10。

2.2 MAb亚 型 的 鉴 定利 用Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit抗体亚类鉴定试剂盒鉴定MAb。4D8和4F10二者均为IgG1亚类，轻链均为κ链。

2.3 MAb的特异性及交叉反应性利用IFA检测MAb与各病毒的反应情况，4D8和4F10均能与PRV JS-2012、Bartha-K61反应，但不与HPPRRSV、PEDV和CSFV等病毒反应，说明2株MAb针对PRV毒株有较好的特异性，且与其他毒株不发生交叉反应，结果见图1。

2.4 MAb的IHC鉴定将4D8和4F10 2株MAb的细胞上清作为一抗分别与感染PRV的猪脑组织进行免疫组化反应，病毒感染的脑组织中出现棕黄色着染，结果见图2。

2.5 MAb的Western blot鉴定将JS-2012病毒液经SDS-PAGE电泳后，收取MAb细胞上清作为一抗，HRP标记的山羊抗小鼠抗体为二抗，进行Western blot，结果见图3。

2.6 腹水制备及效价测定杂交瘤细胞4D8和4F10制备的小鼠腹水与感染JS-2012病毒的细胞反应见图4，腹水IFA效价达到1:51 200。

3 讨论

近年来，变异的PRV在我国Bartha-K61疫苗免疫猪场流行，现已分离出一些PRV变异毒株，其中部分毒株的全基因组测序工作已经完成，如 BJ/YT (KC981239)、TJ (KJ789182)[11,12]、ZJ01 (KM061380)[13]、HeN1及本实验室分离的JS-2012 (KP257591)毒株。2011年后分离的PRV流行毒株与早期分离的PRV毒株基因组序列进行比对后，发现PRV流行毒株的基因组发生了较大的变异，主要位于gB等保守糖蛋白基因和gE等毒力基因及一些基因的非编码区等区域[14]；遗传进化分析显示PRV流行毒株基因组位于一个独立的分支。为进一步研究PRV流行毒株的抗原变异情况，建立快速的病毒诊断方法，本研究将JS-2012全病毒纯化灭活后作为免疫原，制备了2株稳定分泌PRV特异性抗体的杂交瘤细胞，分别命名为4D8和4F10。

经亚型鉴定2株MAb均为IgG1 亚类，轻链为κ链，二者均可与JS-2012及Bartha-K61 PRV弱毒疫苗株进行特异性反应，但不与HP-PRRSV、CSFV、PEDV等其他病毒发生交叉反应。IHC结果表明二者可与感染PRV的猪脑组织发生特异性反应。MAb 4D8与处理的JS-2012病毒液进行Western blot时，能与PRV 60 kDa蛋白发生反应，推测其可能是针对PRV某蛋白线性表位的单抗。MAb 4F10与PRV进行Western blot时无明显条带，但MAb 4F10可以进行IFA和IHC反应，推测其有可能是针对JS-2012病毒某蛋白的构象表位产生的抗体。有研究表明，用β-丙内酯灭活纯化的狂犬病毒（Rabies virus，RABV），免疫后得到3株针对N蛋白的单抗，其中1株针对线性表位，能与N蛋白发生IFA、WB和IHC反应，而另2株仅能进行IFA反应，经验证这两个表位为构象表位[15]。本研究采用吡咯（EBI）灭活全病毒，与β-丙内酯作用相似，直接作用于病毒核酸，保持免疫原性，用EBI灭活后的纯病毒粒子作为免疫原，与原核表达或甲醛灭活病毒制备单抗方法相比，更容易产生针对构象表位的抗体。检测结果显示，制备的2株单抗具备较好的特异性和敏感性，2株细胞连续传代及冻存后复苏的细胞均能稳定分泌抗体，表明二者具有较好的稳定性。PRV流行毒株单抗的制备为今后抗原表位分析检测和猪伪狂犬病的诊断奠定了基础。

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PREPARATION AND CHARACTERIZATION OF MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST PORCINE PSEUDORABIES VIRUS VARIANTS

LIU Fei, TONG Wu, YANG Shen, ZHENG Hao, LI GUO-xin, LIANG Chao, TIAN Qing, TONG Guang-zhi
(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

In order to generate the monoclonal antibodies (MAbs) against a variant of Porcine pseudorabies virus (PRV), BALB/c mice were immunized with purif ed and inactivated PRV JS-2012 strain. Two hybridomas secreting PRV specif c MAbs were obtained and designated as 4D8 and 4F10, respectively. Both MAbs belonged to IgG1 subgroup and had κ light chains. The ascetic f uids containing either 4D8 or 4F10 showed indirect immunof uorescence assay (IFA) titers at 1:51200. Both MAbs reacted specif cally with PRV in IFA and immunohistochemical (IHC). In Western blot, MAb 4D8 reacted with 60 kDa protein of PRV while MAb 4F10 showed no obvious reactions with PRV protein, suggesting that MAb 4F10 might react with a conformational epitope. The availability of PRV MAbs was important for further research of antigenic variation and diagnosis.

Pseudorabies virus; monoclonal antibody; indirect immunof uorescence assay (IFA); immunohistochemical (IHC)

S852.659.5

A

1674-6422（2015）03-0007-05

2015-03-09

上海市自然科学基金项目(14ZR1448900)；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(2014JB02)作者简介：刘飞，女，博士研究生，预防兽医学专业

童光志，E-mail：gztong@shvri.ac.cn