新型猪繁殖与呼吸障碍综合征疫苗研究进展

呼高伟，蔡 杰，余婉婷，冯朝兴，王乃东，邓治邦，王爱兵，杨 毅

（1.湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙410128 ；2.天津市滨海新区汉沽茶淀畜牧兽医站，天津 汉沽300480）

猪繁殖与呼吸障碍综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV）是由病毒性抗原PRRSV（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus）引起的，临床上以猪的呼吸和繁殖障碍为主要特征，如猪妊娠后期流产、死胎、木乃伊胎，哺乳仔猪死亡率升高，肥育猪生长缓慢以及各年龄段猪的呼吸道疾病。目前，本病在全球范围内流行，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。我国将高致病性猪繁殖与呼吸综合征列为二类动物传染病。

1 PR R S V 分子结构特征

PRRSV 为不分节段的单股正链RNA 病毒，分子量大小约为15 kb，直径为50～65 nm，有囊膜，包含9 个开放阅读框（Opening Reading Frame，ORFs）（ORF1a，ORF1b 和ORF2-7）分别编码病毒的结构蛋白和非结构蛋白[1]。关于PRRSV 结构蛋白和非结构蛋白的最新发现为研究者对PRRSV 生物学特性和疫苗的研制提供了全新的视野。PRRSV 具有高度的变异性，传统疫苗效果不理想，导致本病愈演愈烈，危害也越来越严重。本文就目前有关抗PRRSV的不同类型新型疫苗的优缺点和设计策略进行探讨，以期为临床实践进行抗PRRSV 疫苗有效选择、对PRRSV 的控制和预防措施，提供理论指导。

2 新型疫苗的开发

2.1 基因工程疫苗 基因工程疫苗具有安全、可修饰性强、制作工艺简单、可同时诱导机体产生体液免疫和细胞免疫反应等优点。目前，针对PRRSV 的基因工程疫苗的研究的候选基因，主要是围绕PRRSV 结构蛋白GP5 进行的，因为GP5 蛋白包含多个中和抗原表位。另外，GP5 是病毒的一个主要结构蛋白，在病毒粒子中存在的量多可以作为很好的免疫原。

2.1.1 DNA 疫苗 DNA 疫苗又称核酸疫苗或基因疫苗，是编码免疫原或与免疫原相关的真核表达质粒DNA（有时也可是RNA），它可经一定途径进入动物体内，被宿主细胞摄取后转录和翻译表达出抗原蛋白，此抗原蛋白能刺激机体产生免疫应答反应，从而起到免疫保护作用。有研究证明，位于GP5 基因中和表位（表位B）上游的“诱饵”表位（表位A）明显影响抗PRRSV 中和抗体的产生。Fang 等[2]通过人工修饰的方法，在GP5 基因中的“诱饵”表位（表位A）和中和抗体表位（表位B）之间插入通用型辅助性T 淋巴细胞表位（Pan DR T-helper cell epitope），以此削弱非中和表位的作用。将经修饰后的GP5 基因制成DNA疫苗，免疫小鼠结果显示，接种修饰GP5 基因后的DNA 疫苗能诱导小鼠产生的中和抗体水平要明显高于野生型GP5 制成的DNA 疫苗，说明经修饰后的GP5 的免疫原性明显增强。有研究证实，将GP5 基因N-端胞外区中部分糖基化位点（Nlinked glycosylation site，NGS）进行突变能增强体外病毒对中和抗体的敏感性和中和表位的免疫活性[3]。

2.1.2 活病毒载体疫苗 腺病毒载体表达系统可高效地传递和表达外源基因的能力，已得到充分证实。而且腺病毒具备病毒颗粒比较稳定、基因组较少发生重排等优点，已经成为最常用的病毒载体之一。研究者Jiang 等[4]结合上述结论，分别构建了表达野生型GP5 和1～4 NGS 突变型：N44S、N44/51S、N30/44/51S、N30/33/44/51S 和N30/33S 的重组腺病毒。这6 种重组病毒分别接种小鼠，结果显示，5 种表达突变型GP5 的腺病毒所诱导的体液免疫反应明显强于表达野生型GP5 的腺病毒，但是它们所引起的淋巴细胞增殖反应却没有明显差异。GP5 蛋白糖基化残基的缺失能明显增强GP5 蛋白的免疫原性，作者推断这可能是因为糖基化残基的去除暴露了GP5 蛋白的某些中和表位。研究者Anbu K[5]利用昆虫杆状病毒表达系统表达产生PRRSV 的包膜糖蛋白GP2a、GP3、GP4、GP5 蛋白，表达产生的抗原蛋白分子跟感染性的PRRSV 病毒颗粒极为相似。这些抗原蛋白分子能够展示在杆状病毒的表面，并且这种新型的杆状病毒能将抗原分子转导进入猪器官细胞内。这种新型抗原分子，接种小鼠后，结果显示，抗原分子能高效地诱导抗PRSSV 中和抗体的产生。

2.1.3 嵌合疫苗 主要是利用RNA 病毒反向遗传操作系统,构建并拯救嵌合病毒和突变病毒来设计新型疫苗。Wang等[6]将疫苗株MLV 和强毒株MN184的非结构蛋白编码区和结构蛋白编码区互换，拯救的rMN184 和rMLV 均为致弱病毒，且rMN184 免疫接种的猪群能快速产生高水平抗体。

2.1.4 DIVA 疫苗 DIVA 疫苗又叫标记疫苗，能将接种疫苗的动物能与野毒感染的动物区分，这有利于病原流行的监测，也有利于猪场的疫病的控制和根除。Lima 等[7]首先鉴定了美洲型PRRSV NVSL 97-7895 的Nsp2 和结构蛋白中的B 细胞抗原表位，随后在感染性克隆中分别对Nsp2 上两个抗原表位编码序列进行缺失，并拯救出突变病毒。其中一个突变病毒FLdNsp2/44 接种猪只的实验结果显示，突变病毒也能刺激机体产生较强的免疫反应，且检测不到缺失表位对应的抗体。而在亲本病毒接种的猪血清中，可检测到明显的缺失表位对应的抗体。因此作者认为，该方法可用于PRRSV DIVA 疫苗的研发。

2.1.5 病毒样颗粒亚单位疫苗 病毒样颗粒(Virus-Like Particles，VLPs)是含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒，没有病毒的核酸（DNA/RNA），不能自主复制，其在形态上与真正病毒粒子相同或相似，可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞，有效地诱导机体的免疫系统产生免疫保护反应。病毒样粒子不含有遗传物质，安全性好，所以成为一种理想的预防病毒病的候选疫苗。研究者Nam等[8]利用杆状病毒表达系统将PRRSV 的GP5 和M蛋白进行共表达，构建成一种VLPs。免疫接种小鼠后发现针对GP5 的IgG 滴度水平明显高于对照组。接种VLPs 3 d 后进行检测细胞因子水平，发现免疫接种4.0 μg VLPs 后的小鼠产生的r 干扰素水平（Interferon-gamma，IFN-r），IL-4、IL-10 细胞因子水平较对照组明显增高。VLPs 候选疫苗的开发与研制为抗PRRSV 的疫苗研究提供了新的尝试和思路。

2.1.6 表位疫苗 表位疫苗（Epitope Vaccine）是以抗原表位为基础制备的疫苗，是近期发展起来的一种独特的新型疫苗设计思路。研究者Chen 等[9]发现热休克蛋白GP96 能够增强PRRSV 亚单位疫苗的免疫原性。随后，研究者Chen[10]以GP96作为免疫佐剂，人工合成PRRSV B、T 细胞表位肽段构建成表位疫苗，研究其免疫原性。结果显示，抗PRRSV 的体液免疫和细胞免疫反应明显增强。而且，细胞因子IL-12 和肿瘤坏死因子α分泌水平提高。高致病性蓝耳病JXwn06 株攻毒接种后，猪只的临床症状、病毒血症、病理性器官损伤程度得到明显改善。但是，这种表位疫苗却无法针对高致病性蓝耳病毒感染提供有效地持续性保护。

2.1.7 转基因植物疫苗 转基因植物疫苗（transgenie plant vaccine）或植物疫苗（plant-based vaccine）是借助植物遗传转化载体将抗原基因导入植物，利用植物本身生命活动，使其在植物中表达，生产出能使机体获得特异抗病能力的疫苗。Hu 等[11]将玉米愈伤组织经过遗传学改造，表达PRRSV 的M 蛋白，将转基因植物提取物口服接种小鼠后结果显示，在血清和肠道黏膜都有针对抗原的特异性中和抗体的产生。最后一次免疫刺激接种后，血清中中和抗体滴度达到6.7。在小鼠脾细胞中检测出针对PRRSV 的IFN-γ的分泌。研制成功的食用疫苗，接种机体后能刺激机体黏膜免疫反应的产生，因此在一定程度上可以抵御经消化道传播的疾病，而且可以简化免疫方法，节约成本，具有广阔的应用前景。

3 问题与展望

随着科学技术的发展，国内外针对PRRS 的疫苗研究非常活跃，但PRRSV 仍然是当今危害养猪业的一大难题，这是值得每位研究者思考的问题。另外，针对各种不同的疫苗的免疫效果没有一个统一的评价标准，研制成功的疫苗免疫原性参差不齐。PRRSV 由于其生物学特性、免疫逃避、抗原性、基因型存在广泛的变异性等特征，导致其在猪群中持续性感染。这些问题，大大增加了PRRSV 疫苗研究的难度，但同时也使得更加高效、安全的疫苗研制与开发显得得更加迫切。开发新的抗PRRSV 疫苗的新的策略和需要努力的方向是：（1）设计的疫苗以猪树突状细胞（Dendritic cells，DCs）作为靶标，来增强疫苗的免疫原性[12]；（2）解决抑制协调性T 细胞的作用[13]；（3）强烈诱导产生Ⅰ型干扰素[14]，增强机体非特异性免疫力。另外PRRSV 存在抗体依赖性增强现象，所以不仅要能诱导猪体产生强烈的体液免疫反应，更重要的是能够有效刺激猪体产生较强的细胞免疫，达到对猪体形成完全保护的目的。这将需要对PRRSV 的分子结构和功能，免疫逃避机制进行深入研究，彻底弄清其致病机理。

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