内蒙古和新疆两地草原革蜱源性马驽巴贝斯虫病病原DNA检测

敖敦格日勒，格日勒图，朱玉涛，巴音查汗

（1.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古 呼和浩特010018 ；2.新疆农业大学动医学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

驽巴贝斯虫病是由驽巴贝斯虫（Babesia caball）寄生于马属动物红细胞内所引起的蜱传性血液原虫病。其临床表现为高热、贫血、黄疸、出血和呼吸困难等重剧症状，其急性病例死亡率高，对马（包括所有马属动物）产业的健康发展影响极大。内蒙古和新疆省等我国西北地区当前的马产业(已成了朝阳产业)正在向现代马产业方向发展，马属动物则是在实际生产和养殖产业中占主导地位。驽巴贝斯虫病的存在、流行与传播媒介蜱的孳生和消长密切相关，具有一定的地区性和季节性。根据文献记载，有3 个属的14 种蜱可传播驽巴贝斯虫病，即革蜱属、璃眼蜱属和扇头蜱属[1]。媒介蜱传播马梨形虫病十分广泛，其危害相当严重。近年来驽巴贝斯虫病的流行呈上升趋势，为降低对马属动物养殖业的危害，故对驽巴贝斯虫病的发病时间、流行规律及与媒介蜱的关系的掌握就显得尤为重要。

本文对来自内蒙古某地和新疆和静县牧区采集的蜱虫进行了种属鉴定，并探究所采集蜱虫是否携带驽巴贝斯虫病原。对鉴定后的两地草原革蜱研磨后提取组织DNA，借助Bc48 基因设计特异性引物并进行PCR 扩增，检测出了草原革蜱所携带的蜱源性驽巴贝斯虫病病原。为其作为了解驽巴贝斯虫病在这两个地区的流行情况及综合防治提供科学依据。

1 试验材料与方法

1.1 样品来源 分布于内蒙古的草原革蜱，采自于内蒙古西部的某地区147 只（2014 年3 月）；分布于新疆的草原革蜱，2014 年4 月采自新疆和静县部分山区200 只。

1.2 所采集蜱虫的处理及鉴定 蜱的鉴定和形态描述：对以上两地采到的蜱进行清洗处理,先从外部特征上初步分类,然后借助光学显微镜和有关资料[2-7]进行分类鉴定。

扫描电镜样品制备和电镜观察：将已鉴定的蜱制成扫描电镜样品，即固定、冲洗、脱水、KQ5200 型超声波清洗器清洗，临界点干燥法干燥、粘样品、镀金，然后在扫描电镜下观察并拍照。

1.3 蜱源性驽巴贝斯虫DNA提取 先将清洗处理后的草原革蜱研磨；利用购自北京赛百盛基因技术有限公司的DNA提取试剂盒（均购自北京赛百盛基因技术有限公司），按其说明书进行提取蜱虫基因组DNA。提取的DNA于-20 ℃保存备用。

1.4 诊断性PCR 引物设计 参考驽巴贝斯虫Bc48 基因序列设计了1 对引物，其中驽巴贝斯虫的上游引物为5′-GCGACGTGACTAAGACCTTATTGG-3′；下游引物为：5′-GTTCTCAATGTCAGTAGCATCCGC-3′。扩增驽巴贝斯病原长为452 bp 的特异性片段。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.5 PCR 反应体系、反应条件及产物检测 PCR 扩增试剂均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。PCR 扩增的反应体系为：体系总体积25 μL，其中Mix 12.5 μL，上下游引物（umoL/L）各1 μL，DNA模板2 μL，灭菌去离子水补足至25 μL。PCR 扩增条件：94 ℃变性1 min，35 个循环扩增（94 ℃，30 s；56 ℃，45 s；72 ℃，1 min），72 ℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

2 试验结果

2.1 草原革蜱形态学鉴定 在光学显微镜下，草原革蜱主要形态特征：假头基矩形，有珐琅彩，颈沟前端深陷，眼较突出，位于盾板前侧缘，气门板逗点状，达不到盾板边缘。

表1 草原革蜱在扫描电镜下的形态特征

在扫描电镜下，草原革蜱主要形态特征：孔区较大，卵圆形向外斜置（见图1A）。须肢第二节背后缘有细小的短刺（见图1A）。齿式3|3（见图1B）。气门板逗点状（见图1C），无几丁质增厚部。基节I 外距短于或等于内距之长，基节IV向后方显著伸长，其外距不超过该节后缘（见图1C）。采自于两地的草原革蜱形态基本相似。

图1 草原革蜱

2.2 蜱源性驽巴贝斯虫的PCR 检测结果 提取了采自于内蒙古西部某地的草原革蜱（N=147 只）和新疆和静县山区草原革蜱（N=200 只）共347 只蜱虫唾液与血淋巴DNA，并对蜱源性DNA样品进行PCR 检测，检测结果得到了与预期相同大小的452 bp 特异性阳性条带，见图2。表明了该种属媒介蜱虫携带驽巴贝斯虫，可估测是当地传播马驽巴贝斯虫的主要媒介蜱种。

图2 内蒙古、新疆两地部分草原革蜱源性驽巴贝斯虫PCR样品检测结果

2.3 采自于内蒙古、新疆两地草原革蜱携带驽巴贝斯虫的阳性率 在被检测347 份疑似蜱虫中，内蒙古某地区草原革蜱携带驽巴贝斯虫阳性数为12 份，新疆地区草原革蜱携带驽巴贝斯虫阳性样品为27 份（见表2）。由此得出内蒙古西部地区草原革蜱携带驽巴贝斯虫的阳性率为8.16%，新疆地区草原革蜱携带驽巴贝斯虫的阳性率为13.50%，表明内蒙古和新疆所采集到草原革蜱的区域均存在驽巴贝斯虫。

表2 驽巴贝斯虫病感染情况

3 讨论与分析

草原革蜱是马驽巴贝斯虫病的主要传播媒介之一，通常分布于牧区草原。草原牧区的媒介蜱叮咬马属动物导致发生驽巴贝斯虫病。因此，通过提取蜱源性驽巴贝斯虫DNA来推测、判断马驽巴贝斯虫病是至关重要的。经本试验鉴定了采自于内蒙古和新疆某些地区的草原革蜱，发现两地均分布同一种蜱种-草原革蜱，其在形态结构基本相似，据扫描电镜观察其假头基、孔区、气门板、基节内外距、齿式等形态学特征，可作为其鉴别的依据；经PCR 检测发现，同一种蜱的分布区域不同，其携带病原的阳性率也不同,这符合郝广福等[8]的分析，即不同的地理生态条件和种属特异性可能是形成这些感染格局的主要原因。

我国关于该病方面有些报道，罗金等[9]通过PCR 方法测得马血液驽巴贝斯虫病的阳性率为26.67%；沈丹等[10]采用酶联免疫吸附试验和涂片镜检的方法对广州地区的马属动物进行了马梨形虫病调查的结果为1.9%；龚珍丽等[11]通过建立的驽巴贝斯虫病间接ELISA检测出驽巴贝斯虫病的阳性率为17.6%（3/17），各地区马感染该病的感染率均存在差异[12-13]。本试验是通过特异性引物和PCR 扩增，得出了该种蜱携带的病原特异性DNA阳性条带。即内蒙古和新疆两地的草原革蜱携带驽巴贝斯虫的阳性率分别为8.16%、13，50%。因此，这两个地区养殖农户应该提高防蜱意识，加强对马驽巴贝斯虫病的预防与治疗工作的同时，加强媒介蜱虫-草原革蜱的预防措施，保障马产业的健康发展。

[1]李德昌.我国马梨形虫病及其传播者—蜱的地理分布[J].中国人民解放军兽医大学学报，1986，6（3）：279-283.

[2]吕文祥.牛羊蜱传性血液原虫超微结构研究[J].中国兽医科技，1997.27（5）：10-12.

[3]陆宝麟.中国主要医学动物鉴定手册[M].北京：人民卫生出版社，1982：805-819.

[4]徐秉锟.人畜寄生虫电镜图谱[M].北京：人民卫生出版社，1988：160-163.

[5]于心.新疆蜱类志[M].乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1997：54-55，76-77.

[6]巴音查汗，徐显曾.森林革蜱与草原革蜱的超微形态学比较[J].中国兽医科技，2001，27-30.

[7]白音查汗，王光雷，徐显增，等.草原革蜱形态学及生活史研究[J].新疆：草食家畜（季刊），1999，12（4）：45-47.

[8]郝广福，李宏，孙毅，等.内蒙古部分边境口岸地区主要蜱类及蜱媒病原检测[J].中华流行病学杂志，2009，4（30）：365-368.

[9]罗金，刘光远，谢俊仁，等.驽巴贝斯虫病PCR 检测方法的建立和应用[J].中国畜牧兽医，2011，32（1）：193-195.

[10]沈丹，薛红，张海明，等.广州及其周边地区马梨形虫病血清流行病学调查[J].广东畜牧兽医科技，2012，29（7）：17-19.

[11]龚真莉，刘光远，谢俊仁，等.驽巴贝虫病间接ELISA检测方法的建立[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2010，28（3）：200-204.

[12]高志刚，马建山，王宇，等.内蒙古通辽市山地草原地区牧场焦虫病诊疗及分析[J].农业与技术，2014，34（3）：174-175.

[13]陈泽，杨晓军，杨晓红，等.中国蜱类地理分布及区系分析[J].四川动物，2008，27（5）：820-823.