肠道共生菌对哺乳动物肠道屏障调控的研究

杨桂连，王秋东，李雨宸，王春凤，（吉林农业大学动物科学技术学院吉林省动物微生态制剂工程研究中心，吉林长春130118）

肠道共生菌对哺乳动物肠道屏障调控的研究

杨桂连，王秋东，李雨宸，王春凤，
（吉林农业大学动物科学技术学院吉林省动物微生态制剂工程研究中心，吉林长春130118）

哺乳动物胃肠道定植着1014个细菌，这些细菌与宿主建立了一种终生的互利共生关系。肠道微生物在免疫系统的成熟及肠道屏障功能中起到关键作用，相反改变肠道微生物的定植可能导致过敏和炎症反应[1]。肠道屏障通过激活一些机制如微生物信号的识别，抗菌肽、黏液层的产生及抗体的分泌将微生物与肠道组织隔离[2]。最近研究发现，共生菌能够作为肠道屏障功能关键性调节因子对肠道屏障的完整性具有保护作用[3]。本文主要对共生菌如何调控肠道屏障以维护肠道的完整性等最新研究做一综述。

1　肠道屏障的构成

有效的肠道屏障由物理屏障、细胞屏障及化学屏障组成。物理屏障主要为覆盖在肠道上皮细胞表面的黏液层；细胞屏障包括肠道上皮细胞及一些免疫细胞；化学屏障主要由上皮细胞分泌的抑菌肽组成[4]。肠道屏障不仅是抵御病原微生物入侵肠组织的关键，也是维持肠道完整性及稳态平衡的基础。其中屏障中的物理、细胞屏障和化学屏障相互联系且缺少其中的任何一种因素都会影响屏障功能最终都可导致炎症性肠道疾病。

2　肠道屏障控制肠道内环境稳定

尽管肠道管腔存在大量的微生物及饮食抗原，在正常情况下宿主与肠道间一直维持免疫平衡，并且通过一系列的紧密调节以抑制剧烈的炎症反应。因此肠道屏障与先天免疫系统的效应机制一起限制肠道微生物的大面积侵袭。

2.1肠道上皮细胞控制肠道内环境稳定肠道上皮细胞是肠黏膜屏障的主要组织结构基础，细胞间的连接复合体参与维持上皮细胞的完整性，其中紧密连接（TJ）是细胞间最重要的连接方式。TJ主要由跨膜蛋白（occludin蛋白和claudin蛋白）和细胞质蛋白（ZO-1蛋白等）组成[5]。其作为动态的通透性屏障具有双重功能：阻止潜在的有害物质或病原体进入机体，同时允许营养物质、离子和水进入体内以调节肠道通透性。

此外肠道上皮细胞还被认为是管腔内容物的第一传感器。肠道屏障中的上皮细胞能够表达一系列的模式识别受体包括Toll样受体，核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）样受体（属胞内感应分子如NLRP3）等，这些受体能够识别病原微生物细胞表面或胞内的分子标志即病原相关分子模式。当识别到病原微生物后上皮细胞以某种方式把信息传递给下面的免疫细胞继而引发机体免疫应答[6]。因此肠道屏障通过上皮细胞间紧密连接及传递微生物信号以维护体内稳态平衡。

2.2抗菌肽维持控制肠道内环境稳定潘氏细胞主要存在于肠道隐窝底部，为分泌型细胞，它们可直接通过激活MyD88依赖的TLR信号肽途径或L-22/IL-23途径特异性产生具有杀菌作用的抗菌肽[7]。抗菌肽主要为防御素类、溶菌酶和内源性抗菌多肽类物质等，其中人防御素5（HD5）在肠道储存量可达90～450 μg/cm2足够杀灭肠道病原微生物、溶菌酶可抑制革兰阳性（G+）菌，而PLA2可抑制鼠伤寒沙门菌的生长。

最新的研究已经表明，这些抗菌肽不仅能够消灭入侵肠道的病原微生物而且还影响肠道菌群的组成。研究发现，当小鼠缺乏α-防御素或过度表达人源潘氏细胞的α-防御素5时，即使小鼠肠道细菌总数不变，但两组小鼠却含有截然不同的菌群组成[8]。因此，抗菌肽不仅在防止共生菌和致病菌穿透肠道屏障方面至关重要，而且在黏膜表面控制一些细菌过度生长、维持菌群稳态平衡方面也发挥重要作用。

2.3黏液层控制肠道内环境稳定研究发现，肠道上皮组织上覆盖了一层黏液层，其主要成分为黏蛋白，主要由MUC1、MUC2等组成，同时还含有分泌性抗体IgA，由上皮中的杯状细胞产生和分泌。黏液层由内外两层黏液构成，内黏液层则起到了一层物理屏障的作用使肠道共生菌被隔离在稀疏的外黏液层中，因此在靠近上皮组织的地方形成一个没有细菌的隔离区[9]。研究还发现，不同的肠道组织其黏液层的黏稠程度也会出现明显差异。例如，结肠受到一层内黏液层的保护，这层黏液和结肠上皮细胞紧密的结合在一起，保护其免受细菌和机械应激刺激的伤害。而尽管小肠黏液层则非常稀薄，却含有丰富的抗菌蛋白RegIIIγ，它有助于避免细菌与小肠肠道上皮细胞发生接触。同时小肠杯状细胞还可以不断分泌黏液，对黏液层起到补充和更新的作用，给小肠持续的保护[10]。因此，肠道黏液层通过限制微生物对肠道屏障的黏附及损伤维护肠道内环境稳定。

3　肠道共生菌对肠道屏障的调节

3.1共生菌对肠道上皮细胞的影响

3.1.1共生菌影响肠道上皮细胞的更新在肠道屏障功能正常的情况下，细胞增殖与死亡始终维持一种平衡关系。大量研究显示，无菌动物与正常动物相比其肠道微生物的缺乏能够极大的损害肠道结构及影响肠道上皮细胞的更新[11]。肠道细胞更新的减少可能损害上皮细胞的增殖以及再生能力，同时更易发生炎症的感染。实验证实，无菌小鼠更易感染DSS导致的结肠炎，而当无菌小鼠口服灌胃乳酸杆菌通过其在肠道上皮细胞的定植能够促进细胞的更新和黏膜的修复能力，进而能够抵御DSS诱导的结肠炎[12]。这表明肠道微生物能够通过调节肠道上皮细胞的更新与修复能力以抵御肠道损伤。然而共生菌信号如何作用于上皮细胞以促进细胞更新和损伤修复还不清楚。但是微生物能够产生多种短链脂肪酸如丁酸、琥珀酸及丙酸等这些脂肪酸对调节结肠上皮细胞增殖、分化至关重要，同时也是结肠重要的能量来源[13]。因此肠道屏障功能的维护需要肠道微生物的调节。

3.1.2共生菌影响肠道渗透性研究发现，肠道微生物具有影响肠道渗透性的能力。当机体受到剧烈压力时，大分子流量增加、离子分泌发生改变继而诱导屏障功能发生障碍。然而口服共生菌如乳酸菌能够防止由压力诱导的肠道屏障的改变。在小鼠DSS诱导的结肠炎期间服用大肠杆菌或乳酸菌能够阻止由结肠炎引发的肠道屏障功能障碍[14]。一些研究已经表明，肠道上皮渗透性的增加可能与细胞紧密连接发生改变有关。无菌小鼠单独定殖双歧杆菌其能够上调小脯氨酸丰富蛋白-2基因的表达，以加强肠道屏障防御功能[15]。同样无菌小鼠单独定殖大肠杆菌Nissle1917后导致肠道上皮细胞ZO-1蛋白的表达上调[14]。益生菌乳酸菌的裂解物通过抑制通透性的增加及对ZO-1蛋白表达的保护能够使小鼠DSS结肠炎得到改善[16]。虽然大量的数据表明，益生菌在调节肠道屏障功能和完整性上具有重要作用，但是乳酸菌与其他共生菌影响肠道渗透性的机制仍不清楚。

3.2共生菌对抗菌肽的影响抗菌肽具有限制病原菌侵入和调节肠道微生物组成双重作用。研究发现，潘氏细胞衍生的抗菌肽如溶菌酶、sP⁃LA2在无菌的肠道中表达。同样隐窝素在肠道微生物缺乏时表达，这表明这些分子的基础表达不需要来自肠道微生物的信号[17]。然而与无菌小鼠相比正常小鼠肠道中隐窝素相关序列（CRS）显著增高，这表明肠道微生物可能影响隐窝素的表达水平[17]。研究发现，在未断奶小鼠及大鼠肠道中α-防御素及隐窝素表达量较低，但是在成年期则显著增高[18]。哺乳动物从出生到成年每个个体都会经历一次微生物在肠道定植的变迁。这种定植模式在成年期稳定，然后每个个体都会拥有一种特定的肠道菌群。而当肠道菌群稳定定植时α-防御素表达增高，这表明微生物的成分可能对α-防御素的调节起到一定作用[19]。相反真菌类及原虫则不能影响潘氏细胞分泌抗菌肽。

3.3共生菌对黏液层的影响与正常小鼠相比，无菌小鼠分泌黏蛋白的杯状细胞数量显著降低，此外，无菌小鼠黏液层较为稀薄，致密性较差。无菌小鼠定植共生菌后细菌所产生的LPS及肽多糖能够使黏液层的厚度增加到接近正常水平[20]。因此这个发现表明，肠道共生菌的成分能够对黏液层具有一定的调节作用。大鼠服用VSL#3(由八种益生菌组成)能够诱导MUC2表达及分泌[21]。在VSL#3各个益生菌中乳酸菌对MUC2起到较强的调节作用，但是乳酸菌诱导MUC2表达的确切机制还不清楚。此外VSL#3还能诱导大鼠肠道MUC1,3的表达及分泌。黏蛋白对于防止管腔中的细菌黏附及侵入肠道上皮至关重要，其主要依赖于黏蛋白类碳水化合物成分。因此肠道屏障与微生物之间存在双向作用，这对肠道的健康至关重要。

4　结语

驻留在肠道管腔中的复杂微生物群与宿主存在一种互利共生关系。微生物成分的破坏有可能改变宿主健康状况进而引发胃肠道炎症疾病。现在研究已经表明，共生微生物与肠道屏障功能相互作用，但是确切的分子及细胞机制还不清楚。了解共生微生物与肠道上皮屏障的相互作用将为肠道慢性炎症提供新的治疗及预防策略。这些策略可能基于使用特异性微生物以调整肠道屏障功能进而阻止肠道炎症的发生。但是关于潜在有益菌株的筛选以及在治疗过程中对宿主的影响需要在日后加以解决。

参考文献：

[1] Blumberg R，Powrie F.Microbiota, disease, and back to health：a metastable journey[J] . Sci-ence Translational Medicine，2012，4 （137）：137rv7.

[2] Natividad J M，Huang X，Slack E，et al.Host responses to intesti⁃nal microbial antigens in gl-uten-sensitive mice[J] . PLoS One，2009，4（7）：e6472.

[3] Hooper L V，Gordon J I . Commensal host-bacterial relationships in the gut[J].Science，2001，292（5519）：1115-1118.

[4] Rescigno M.The intestinal epithelial barrier in the control of ho⁃meostasis and immunity[J].Trends Immunol，2011，32（6）：256-263.

[5] Kau A L，Ahern P P，Griffin N W，et al.Human nutrition, the gut microbiome and the immune system[J].Nature，2011，474（7351）：327-336.

[6]曾敬清，刘伟，周同，等.肠上皮细胞的免疫调节与炎症性肠病[J].临床儿科杂志，2011，29（11）：1092-1094.

[7] Kinnebrew M A，Buffie C G，Diehl G E，et al . Interleukin 23 P roduction by Intestinal CD103+CD11b+Dendritic Cells in Re⁃sponse to Bacterial Flagellin Enhances Mucosal Innate Immune Defense[J].Immunity，2012，36（2）：276-287.

[8] Salzman N H，Hung K，Haribhai D，et al . Enteric defensins are essential regulators of intestinal microbial ecology[J] . Nat Immu⁃nol，2010，11（1）：76-83.

[9] McGuckin M A，Lindén S K，Sutton P，et al . Mucin dynamics and enteric pathogens[J].Microbiol，2011，9（4）：265-278.

[10] Johansson M E，Hansson G C.Keeping Bacteria at a Distance[J]. Science，2011，334（6053）：182-183.

[11] Cerf-Bensussan N，Gaboriau-Routhiau V . The immune system and the gut microbiota: friends or foes[J] .Nature Reviews Immu⁃nology，2010，10（10）：735-744.

[12] Maslowski K M，Vieira A T，Ng A，et al.Regulation of inflamma⁃tory responses by gut microbiota and chemoattractant receptor gpr43[J].Nature，2009，461（7268）：1282-1286.

[13] O’Keefe S J.Nutrition and colonic health：the critical role of the microbiota[J] . Current Opinion in Gastroenterology，2008，24 （1）：51-58.

[14] Ukena S N，Singh A，Dringenberg U，et al.Probiotic Escherichia coli Nissle 1917 inhibits leaky gut by enhancing mucosal integrity [J].PLoS One，2007，2（12）：e1308.

[15] Gareau M G，Jury J，MacQueen G，et al . Probiotic treatment of rat pups normalises corticosterone release and ameliorates colon⁃ic dysfunction induced by maternal separation[J] . Gut，2008，57 （4）：560.

[16] Zakostelska Z，Kverka M，Klimesova K，et al.Lysate of probiotic Lactobacillus casei dn-114001 ameliorates colitis by strengthen⁃ing the gut barrier function and changing the gut microenvi-ron⁃ment[J].PLoS One，2011，6（11）：e27961.

[17] Ayabe T，Wulff H，Darmoul D，et al.Modulation of mouse paneth cell alpha-defensin secretion by mikca1，a Ca2+-activated，inter⁃mediate conductance potassium channel[J] . Journal of Biological Chemistry，2002，277（5）：3793-3800.

[18] Mallow E B，Harris A，Salzman N，et al . Human enteric defen⁃sins.Gene structure and deve-lopmental expression[J] .Journal of Biological Chemistry，1996，271（8）：4038-4045.

[19] Kurokawa K，Itoh T，Kuwahara T，et al.Comparative metagenom⁃ ics revealed commonlye-nriched gene sets in human gut microbi⁃omes[J].DNA Research，2007，14（4）：169-181.

[20] Petersson J，Schreiber O，Hansson G C，et al.Importance and reg⁃ulation of the colonic muc-us barrier in a mouse model of colitis [J] . American Journal of Physiology：Gastrointestinal and Liver Physiology，2011，300（2）：G327-G333.

[21] Caballero-Franco C，Keller K，De Simone C，et al.The vsl#3 pro⁃biotic formula induces m-ucin gene expression and secretion in colonic epithelial cells[J] .American Journal of Physi-ology：Gas⁃trointestinal and Liver Physiology，2007，292（1）：G315-G322.

通讯作者：王春凤，E-mail：wangchunfeng@jlau.edu.cn

作者简介：杨桂连（1978-），男，副教授，博士生，从事动物寄生虫免疫防治研究，E-mail：yangguilian@jlau.edu.cn

基金项目：国家863计划项目（2011AA10A215，2013AA10280-6）；国家自然科学基金项目（31272552，31272541，81170358，3137-2462）；教育部新世纪优秀人才支持计划项目（NCET-10-0175）；吉林省科技发展计划项目（20111816, 20080104）；吉林省世行贷款农产品质量安全项目（2011-Y07）

收稿日期：2014-07-14

中图分类号：S852.4

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2015）10- 0060- 03