现有液体培养法检测解脲脲原体效果的评价

周良佳，连大帅，许 锴，伊科拉木，普琼次仁，吴建茹，陈璐斯，杨 天，谢彦昕，王 蓓

现有液体培养法检测解脲脲原体效果的评价

周良佳，连大帅，许 锴，伊科拉木，普琼次仁，吴建茹，陈璐斯，杨 天，谢彦昕，王 蓓

目的 以固体培养基为金标准，对现有液体培养法进行评价，并进一步探讨改良的方法。方法 用液体培养基、新型固体培养基及梅里埃培养基平行检测63例临床宫颈分泌物试子，根据灵敏度、特异度、假阳性率、假阴性率等指标对现有液体培养法、梅里埃培养基检测Uu的效果进行评价。结果 液体培养法Uu检出率为36.7%，梅里埃培养基Uu检出率为66.7%，新型固体培养基Uu检出率为84.1%。以固体培养基为金标准，液体培养法的灵敏度较低(42.0%)，假阴性率较高(58.0%)，特异度尚可(90.0%)。梅里埃培养基检测Uu的灵敏度(72.9%)明显优于液体培养法(42.0%)。结论 有过滤步骤的传统液体培养法的假阴性率过高，考虑改良现有液体培养基，提高检测支原体的真实性和可靠性，建立方便使用且结果真实可靠的检测Uu的方法。

解脲脲原体；液体培养基；新型固体培养基；梅里埃培养基

解脲脲原体(Ureaplasmaurealyticum，Uu)是泌尿生殖道的常见微生物，与许多泌尿生殖道疾病，如非淋菌性尿道炎、宫颈炎、阴道炎有关，也是男性不育、女性不孕及不良妊娠的常见病因之一。因此，准确检测Uu对临床诊断和治疗具有重要意义。目前，国内对支原体的临床检测常采用液体培养法，这一方法方便、快捷、灵敏度高，已沿用近20年，但液体培养仅是生化反应，而生化反应不是支原体所特有的，一旦有其他能分解尿素的微生物在培养基中生长，就会导致假阳性判断。固体培养法可以通过显微镜观察支原体特有的菌落形态，是微生物诊断的直接证据。但由于支原体在固体培养基上菌落形态小，需借助显微镜方法观察，且生长环境需要CO2，生长时间长，没有药敏鉴定，不适合临床常规检查。近年来，上海叶元康等学者研制开发了新型固体培养基，与传统固体培养基相比，选择性强，支原体菌落出现早，特征易于判断，但该新型固体培养基在临床还未能得到广泛应用。本研究将采用新型固体培养基、现有液体培养基、梅里埃培养基，通过对妇科及性病门诊就诊者泌尿生殖道标本的平行检测，对现有液体培养法的灵敏度、特异度、假阳性率、假阴性率以及符合率进行评价。

1 材料与方法

1.1 样本来源 泌尿生殖道标本取自妇科门诊有泌尿生殖道感染症状的就诊者，采用无菌的试子采取女性宫颈分泌物，标本采集后立即送检。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂 液体培养基 国内常用的Uu液体培养基，购自南京黎明生物制品有限公司；新型固体培养基：含有多胨等基础营养成分和0.9%琼脂，增加血清含量，添加细胞培养液(10%DMEM)促进支原体生长，抑菌剂除传统的青霉素外还添加了非抗生素类抑菌成分，购自河北微拉生物科技有限公司；梅里埃培养基：法国Bio-Merieux公司的Mycoplasma ID2培养基。具有半定量计数功能，可检测标本中支原体数量是否超过104ccu/mL，并以此判断“正常携带”或“感染”。该试剂及判断界值已为国际上所公认。

1.2.2 仪器 SHEL LAB恒温培养箱，SW-CJ-1F净化工作台，培养瓶，直径25 mm滤菌器，孔径0.22 μm滤膜，2 mL注射器，奥林巴斯Olympus FSX100智能生物图像导航仪。

1.3 培养方法与结果判读 将采集的宫颈分泌物试子洗脱于1 mL生理盐水中，此为样本洗脱液。严格按照各种检测试剂的使用说明，在无菌条件下将样本洗脱液分别接种于液体、新型固体培养基和梅里埃试剂盒的各个培养孔中，同时设立阴、阳性对照(阴性对照为培养基空白对照，阳性对照为本实验室保留的Uu标准菌株接种于各种培养基上)，置37 ℃恒温培养箱中培养，24 h，48 h各观察1次。

1.3.1 液体培养法的步骤与结果判读 取150 μL洗脱液接种到1.5 mL液体培养基中，标记好后置37 ℃恒温培养箱中培养。在阴性对照保持黄色澄清和阳性对照变红色澄清的前提下，1代培养物由黄转红判为1代阳性，然后用滤膜孔径为0.22 μm的滤膜进行过滤并再培养，1代阳性过滤后培养液由黄色变为红色且澄清判为阳性，出现红色混浊表示受到污染，则剔除。1代以及2代培养液颜色为黄色的判为阴性。

1.3.2 固体培养法的步骤与结果判读 取150 μL(约5～6滴)洗脱液均匀平铺于新型固体培养基上，标记好后置37 ℃恒温培养箱中培养，24 h，48 h各观察1次。经48 h的培养后，于低倍镜中观察可见到特征性的菌落。解脲脲原体菌落小，圆形棕褐色，呈棕黑色海胆样菌落(10～50 μm)，黑色的芯子和褐色周边。

1.3.3 梅里埃培养法的步骤与结果判读 取200 μL洗脱液接种于梅里埃培养基的R1剂中混匀，然后与R2剂振荡混匀，并分别接种于鉴定试剂条的各反应杯内，每反应杯加55 μL，标记好后置37 ℃恒温培养箱中培养，24 h，48 h各观察1次。在24 h和48 h孵育后，尿素-精氨酸肉汤颜色为橙至红色都可判读为阳性，肉汤颜色为黄色时判读为阴性。支原体鉴定试剂条的鉴定孔，颜色为橙色至红色可判定为阳性，黄色为阴性；计数孔颜色呈红色判断为阳性即Uu的数量>104ccu/mL，计数孔颜色为黄色至橙色可判断为阴性即Uu的数量<104ccu/mL。

1.4 统计学分析 建立检测结果的Excel数据库，用Spss19.0软件进行数据分析。采用配对χ2检验对不同培养基检测Uu的结果进行比较分析，P<0.05为差异有统计学意义。采用灵敏度、特异度、假阳性率、假阴性率以及符合率等指标对现有液体培养法进行综合评价。

2 结 果

2.1 不同培养基对解脲脲原体的检出情况 本次共采集临床宫颈分泌物样本63例。液体培养基Uu初筛阳性率为77.8%(49/63)，过滤后Uu检出率36.7%(22/60)；梅里埃尿素-精氨酸肉汤阳性率为71.9%(41/57)，Uu检出率为66.7%(38/57)，其中Uu感染率(Uu计数≥104ccu/mL)为35.1%(20/57)；新型固体培养基24 hUu检出率为69.8%(44/63)，48 hUu检出率为84.1%(53/63)。Uu在固体培养基上24 h、48 h、72 h的菌落形状见图1-3，这3张图均为同一视野，同一放大倍数拍照，箭头所指为同一Uu菌落在不同时间的菌落形状，可见，Uu菌落随时间在不断生长，不断增大。

2.2 3种培养基的检测结果比较

2.2.1 液体培养基检测Uu效果评价 以固体培养法48 h检测结果为金标准，计算液体培养法检测Uu的灵敏度、特异度、假阳性率、假阴性率以及符合率,结果见表1。由表1可知，液体培养法初筛阳性率与固体培养法检出率没有差异(χ2=0.643，P=0.424)，但若以液体培养法初筛Uu为检测结果，则特异度较低(50.0%)，假阳性率过高(50.0%)。液体培养法过滤后Uu检出率36.7%明显低于固体培养基48hUu检出率83.3%，差异有统计学意义(χ2=24.300，P<0.001)。液体培养法的灵敏度较低(42.0%)，假阴性率较高(58.0%)，特异度尚可(90.0%)。

Fig.1 24 h (twenty-four hours) colonial morphology ofUuin solid

View from Olympus FSX100 Intelligent creatures image navigation, 400×; plotting scale: 100 μm, the arrow points a singleUucolony.

图3Uu在固体培养基72 h的菌落形状

Fig.3 72 h colonial morphology ofUuin solid

2.2.2 梅里埃培养基检测Uu效果评价 以固体培养基48 h检测结果为金标准，计算梅里埃培养基检测Uu的灵敏度、特异度、假阳性率、假阴性率以及符合率(结果见表2)。由表2可知，梅里埃培养基检测Uu阳性率66.7%低于固体培养基48hUu阳性率84.2%，差异有统计学意义(χ2=5.063，P=0.021)。

2.2.3 液体培养基与梅里埃培养基检测Uu效果比较 根据Mycoplasma IST试剂的检测结果，以≥104ccu/mL为感染判断标准，≤104ccu/mL为正常携带，比较液体培养法Uu检出率与梅里埃培养基Uu检出率，以及比较液体培养法Uu检出率与梅里埃培养基Uu感染率(结果见表3)。由表3可见，液体培养法的Uu检出率(38.9%)明显低于梅里埃培养基Uu检出率(70.4%)，差异有统计学意义(χ2=13.474，P<0.001)，并且同样都以固体培养基为金标准，梅里埃培养基检测Uu的灵敏度(72.9%)明显优于液体培养法(42.0%)。由表3可见，比较液体两步法的Uu检出率(38.9%)与梅里埃培养基检测出的Uu感染率(37.0%)，两者差异没有统计学意义(P=1.000)。

3 讨 论

目前认为，解脲脲原体是性传播疾病的主要病原体之一，在女性泌尿生殖道有很高的携带率(60%～80%)。国外有文献[1]报道，在1 718例泌尿生殖道感染患者中，Uu的检出率为16%，高于阴道毛滴虫(0.2%)，淋病奈瑟菌(0.6%)，生殖支原体(1%)，沙眼衣原体(8%)这些病原体的检出率；国内也有文献[2]报道，女性泌尿生殖道感染中Uu感染率为50.6%，高于淋球菌3.1%、沙眼衣原体10.9%、人型支原体6.3%、念珠菌(20.2%)和滴虫(2.0%)，可见Uu是泌尿生殖道感染的主要病原体之一。

本研究通过对63例宫颈分泌物样本进行Uu检测，固体培养法48 hUu的检出率为84.1%，梅里埃培养法Uu检出率为66.7%。由于本次采集的样本均来自于有明显泌尿生殖道症状的感染就诊者，故Uu的检出率较高。国内外对相似人群的Uu检出率60%～80%左右均有报道。郭爱霞等[3]对1462例泌尿生殖道感染女性患者进行Uu检测，检出率为54.58%；李轶春等[4]用梅里埃培养基进行妇科门诊有生殖道炎症女性泌尿生殖道标本的Uu检测，Uu检出率为49.67%，Uu<104ccu/spec为30.33%,Uu≥104ccu/spec为19.33%；葛萍等[5]对同样人群Uu的检出率为87.8%；国外也有同类研究[6]，其对255份有症状女性阴道分泌物样本进行Uu检测，检出率为68.9%。

既往许多文献[7- 8]报道，液体培养法是生化反应，特异性差，不是支原体所特有，一旦有分解尿素的细菌和真菌就会出现阳性反应，从而导致支原体假阳性判断。既往也有文献[9]报道，液体培养法检测Uu的灵敏度(85.4%)和特异度(90%)都尚可，且不存在假阳性问题。从本实验结果可知，液体培养法的特异度很高(90.0%)，反而灵敏度较低(42.0%)，假阴性率较高(58.0%)。这提示我们在使用液体培养法检测Uu时，要注意假阴性判断。造成液体培养法假阴性率较高的原因，可能是在液体培养过程中采用了过滤这一流程，过滤的时机比较难把握，过早或过晚都会影响过滤后支原体的生长效果，继而可能导致了假阴性率的升高。若省略过滤这一步骤，单纯以液体培养基的初筛结果为检测Uu的结果，则特异度太低(50.0%)，假阳性率过高(50.0%)，且这一结果与陈红霞等[7]报告的59.69%的假阳性率相似，所以单纯以现有液体培养基一代培养阳性为检测结果也是不可取的。

法国Bio-Merieux公司的Mycoplasma IST培养基对Uu的诊断结果及判断界值已被国际上所公认。这次以固体培养基为金标准评价梅里埃培养基的灵敏度与特异度等指标时发现，梅里埃培养基的灵敏度与特异度并不是很高，国外也有研究[10]评价了梅里埃培养基的灵敏度(44.9%)与特异度(87.9%)，灵敏度也不高。这可能是由于梅里埃培养基也是基于生化反应，在指示剂的作用下达到一定的颜色改变以作阳性判断，所以梅里埃培养基有一定的检测限。固体培养基的优点在于灵敏度高，检测限低，且以通过显微镜观察支原体特有的菌落形态，是微生物诊断的直接证据。梅里埃培养基虽然灵敏度不如固体培养基，但其可以做半定量计数检测，判断感染与正常携带，对临床诊断及用药有一定的参考意义，而固体培养基只能鉴定Uu的有无，不易计数，因此不能判断感染的严重程度。此次实验中用到的固体培养基是上海同济大学研制的新型固体培养基，在传统培养基的基础上增加血清含量，添加了细胞培养液(10%DMEM)促进支原体生长，缩短培养周期。但由于支原体菌落较小，无法肉眼观察，需借助显微镜等仪器观察，且杂菌污染率较高，有时会影响镜下观察，可能导致假阴性判断。通过以上比较，固体培养基与梅里埃培养基各有优缺点，但梅里埃培养基可能更适用于临床。

与液体培养法相比，梅里埃培养基检测Uu的灵敏度(72.9%)明显优于液体培养法(42.0%)。虽然梅里埃培养基有很多优点，但其价格昂贵，不适用于大样本检测与临床检验。由于梅里埃培养法与液体培养法原理相似，如果对现有液体培养基进行一定改良，比如调整液体培养基内抗生素的种类及含量，改良液体培养基对Uu培养的效果，使其更适用于临床及科研。

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Effect evaluation of present liquid culture detection method forUreaplasmaurealyticum

ZHOU Liang-jia,LIAN Da-shuai,XU Kai,YIKE Lamu,PUQIONG Ciren,WU Jian-ru,CHEN Lu-si,YANG Tian,XIE Yan-xin,WANG Bei

(DepartmentofEpidemiologyandStatistics,SchoolofPublicHealth,SoutheastUniversity,Nanjing210009,China)

To evaluate the effect of present liquid culture method in detection ofUreaplasmaurealyticum(Uu) on sensitivity, specificity, false positive rate, false negative rate and consistency rate, 63 cases of clinical cervical secretion specimens were detected parallelly by liquid culture, new solid medium and BioM rieuxMycoplasmaID2. As a result,Uupositive rate was 36.7%, 66.7% and 84.1% for liquid culture, BioM rieuxMycoplasmaID2 and solid medium, respectively. Taken solid culture medium as gold standard, the sensitivity of liquid culture method was low (42.0%), the false negative rate was high (58.0%), and the specificity was fair (90.0%). The sensitivity of BioM rieuxMycoplasmaID2 detection ofUu(72.9%) was better than liquid culture method (42.0%). In conclusion, as the false negative rate of present liquid culture method is too high, it should be improved to enhance the validity and reliability of mycoplasma detection, and to establish a more convenient and reliable method for detectingUu.

Ureaplasmaurealyticum; liquid culture method; new solid medium; BioM rieuxMycoplasmaID2

Wang Bei, Email: wangbeilxb@seu.edu.cn

国家自然科学基金(30872156),东南大学大学生科研训练计划(SRTP)项目(13422007)

王蓓， Email:wangbeilxb@seu.edu.cn

东南大学公共卫生学院流行病与卫生统计学教研室，南京 210009

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.01.004

R183.7

A

1002-2694(2015)01-0016-05

2014-03-12；

2014-08-30

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 30872156), and the Southeast University Student Research Training Program (SRTP)(No.13422007)