载脂蛋白E基因型在老年人群中的分布及与老年认知损伤的关系

殷淑琴 聂宏伟 徐 勇(湖州师范学院，浙江 湖州 33000)

老年痴呆已经成为危及老年健康和社会经济发展的重大公共卫生问题。认知功能损伤作为发展为老年痴呆的过渡阶段得到了人们的关注，研究影响认知功能损伤发生的相关因素也成为国内外研究的热点问题〔1～4〕。本次研究针对国内外研究存在很大争议的基因进行分析，旨在为早期预防高危人群提供理论依据。

1 资料与方法

1.1研究对象 在苏州和湖州市农村的5个社区，选取546例老年人作为研究对象，男247例，女 299例，平均年龄(67.25±9.87)岁。由经过系统培训的3名神经内科医师采用蒙特利尔认知功能量表(MOCA)〔5〕对老年人进行认知能力测评。量表评估项目主要包括注意与集中、执行功能、记忆、语言、视结构技能、抽象思维、计算和定向力等8个领域，量表总分30分，其中≥26分为正常，＜26分为轻度认知功能损害〔6〕。

1.2载脂蛋白(Apo)E基因型检测方法〔7〕取血细胞，溶入生理盐水2 ml，采用DNA提取试剂盒，按说明提取DNA，应用琼脂糖凝胶电泳技术检测DNA纯度，再用Eppendorf核酸定量仪测定 DNA 浓度(260 nm 吸光率＞0.05，DNA 含量＞2.0 μg/μl，吸光率A260/A280比值为1.6～1.8，320 nm波长处吸光率接近0)。PCR扩增:根据美国国家生物技术信息中心(NCBI)相关文献提供的研究结果，确定候选目的基因片段，利用GenBank上提供的序列设计引物，由上海生工合成。PCR反应体系(总体系20 μl)采用10×PCR Buffer(含15 mmol/L MgCl2)2 μl，Hot-Star Taq DNA Polymerase(QIAGEN 公司)0.2 μl，5×Q-Solution 4 μl，dNTPmix(每 种 10 mmol/L)2 μl，Primer1 1 μl，Primer2 1 μl，模板 DNA 1 μl，蒸馏水 8.8 μl。将测序样本置 ABI-2700型扩增仪中95℃ 预变性15 min，用Touchdown-PCR，94℃变性50 s，63℃ ～58℃退火 1 min(－0.5℃ /1 min)，72℃延伸 1 min，共循环10次，94℃变性50 s，57℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，共循环30次，最后于72℃延伸10 min。用1.5%琼脂糖凝胶电泳观察PCR扩增产物是否为单一目的条带，根据V-GENE公司提供的PCR纯化试剂盒，对PCR产物过柱纯化后，进行测序反应:反应体系 1 μl BigDye(2.5 倍)+1.5 μl BigDye Seq Buffer(5 倍)+3 μl引物+1 μl PCR 纯化产物+3.5 μl双蒸水。测序热循环条件:96℃，10 s→(96℃10 s→50℃5 s→60℃4 min)×25个循环→60℃，4 min→4℃保温。测序反应后纯化:每管加入125 mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA)1 μl到管底，再加入3 mol/L醋酸钠(NaAc)1 μl→每管加入 100% 酒精 25 μl，铝箔封严密，震荡混匀4次，室温放置15 min→1 600 r/min，离心45 min，马上倒置于96孔ABI板，离心至185 r/min，停止离心→每管加入 75% 酒精35 μl，1 650 r/min，4℃ 离心 15 min(JOUANBR4i);立即倒入96孔板，离心至185 r/min停止离心→重复第4步骤1次→室温挥发净酒精，加入10 μl Hi-DiFormamide溶解DNA→样品在95℃变性4 min，迅速置冰中冷却4 min。基因测序:电泳前，在数据采集(DataCollection 2.0)软件中选择正确的运行模块和分析模块。上样至3100-Avant遗传分析仪进行电泳。应用Data Collection软件自动进行数据处理和分析。结果分析:将测序结果用DNA Sequencing Analysis 5.1自动分析原始测序数据，获得测序电泳图和序列。将样品序列用DNA Star Seqman与标准序列进行比对，观察样本基因序列的多态性。

1.3统计学分析 采用SPSS18.0软件行χ2检验。

2结果

2.1老年人群ApoE基因型分布情况分析 ApoE基因型分布中E3/3纯合子频率最高，占 72.89%，E2/2型最少，仅占1.28%，其余E3/4型占11.90%、E2/3型占8.61%、E4/4型占3.3%、E2/4占2.01%。

2.2老年认知损伤与ApoE基因型的关系 根据MoCA检测结果，546例老年人中有189例老年人为认知损害。以189例老年认知损害作为病例组，以其余357例为对照组，比较两组ApoE基因型频数分布情况，结果表明，认知损伤的老人中携带ApoE E4等位基因率明显高于对照组〔32.3%(61/189)vs 9.2%(33/357)，χ2=46.658，P＜0.001〕，病例组 E2(3/189)、E3(125/189)与对照组E2(4/357)、E3(320/357)比例无显著差异(P＞0.05)。

3讨论

认知功能损伤人群痴呆的转化率为正常人群的10倍，给社会和家庭带来的沉重的负担〔8〕。预防及控制老年痴呆的发生成为临床医生和公共卫生专家关注的重点。针对可能预防的因素进行重点预防，对认知功能损害的高危人群进行重点干预是改善老年人健康的重要策略。国内外研究认为影响认知功能损伤的因素很多，包括生活习惯等因素:高血压、高脂血症、糖尿病、冠心病、吸烟、饮酒、抑郁等〔9～11〕，还包括体质指标:淀粉样前体蛋白(APP)、氧化因子、炎症因子、神经生长因子(NGF)、氨基酸、tau蛋白和Aβ等，ApoE作为一个高危因素引起了研究人员的重视。

人群ApoE基因具有明显的遗传多态性，共有6种表型，是根据三种等位基因不同组合后产生的3种纯合子E2/2、E3/3、E4/4和3种杂合子E3/2、E4/3、E4/2。当前研究认为ApoE基因与认知功能的损伤存在很大的相关性，Borenstein等〔12〕研究认为，E3/3等位基因的存在是认知功能损害的危险因素，与Niti等〔13〕研究结论一致;Unverzagt等〔14〕对非洲人种的基因状况进行研究，结果表明不存在种族的差异性;Erdan〔15〕、吕小荣等〔16〕学者对中国人群进行研究，均认为E3/3是高危基因，但对E2/2基因是否是低危因素还存在争议。本次研究结论认为ApoE等位基因对认知功能的损伤具有明显的影响，与国内外学者的研究结论一致，但对E2/2基因携带者是否是先天性的低危人群还有待研究。本次研究虽然证明了ApoE基因对老年人认知功能的影响，但还存在一定的局限性:(1)样本量较小，样本人群具有地域局限性;(2)未能评估Apo E基因对老年人认知功能的相对危险度，仅仅是定性研究。因此本次研究的结论还需要长期的大规模随访研究来证实。

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