柑橘黄龙病研究概况

陈凯男，李充璧

(1.内蒙古师范大学生命科学与技术学院，内蒙古呼和浩特 0 10021;2.肇庆学院生物医药工程中心，广东肇庆 5 26061)

柑橘黄龙病是柑橘种植业中的一种毁灭性病害，又称青果病、枯黄病、黄梢病。主要通过柑橘带菌种苗、带菌接穗或带菌柑橘木虱形成病原菌源，然后在柑橘枝条抽发时期进行大面积传播，继而对柑橘生产造成重大灾害。有文史记载，柑橘黄龙病发生由来已久，早在百年之前，已经初步形成灾害，尽管目前柑橘黄龙病的研究较多，但仍然无法全面根治。本文介绍了近年来柑橘黄龙病研究取得的进展，以期为柑橘黄龙病研究工作提供参考。

1 柑橘黄龙病的危害

1919年，在华南地区首次发现柑橘黄龙病［1］。目前为止，中国19个栽培柑橘的省区已经有11个遭受过柑橘黄龙病危害，受灾面积已达总面积的80%，损失产量占总产量的85%左右。2004年和2005年巴西圣保罗州、佛罗里达州分别发生了柑橘黄龙病灾害［2］，给柑橘种植者造成了极大损失。除去地中海盆地、太平洋岛屿、澳洲和西亚之外，亚洲、非洲、大洋洲、美洲的40多个国家都相继发生过柑橘黄龙病灾害［3］。此病存在潜伏期，通常新植株染病后不能及时发现，但1～2年植株会死亡，老龄植株抵抗力相对较强，会在3～5年死亡，严重时经常造成全园感染，损失重大。柑橘黄龙病破坏力巨大，目前还没有根治此病的方法，所以柑橘黄龙病被称作柑橘中的癌症。

2 柑橘黄龙病的症状

患病植株初期叶片呈斑驳状或黄化型，后期出现类似缺锌的症状，整体黄化甚至枯萎。患病植株开花早，结果率低，产量锐减，所结果实小，颜色不正常，俗称“红鼻果”或“斜肩果”，品质较差。夏梢和秋梢比春梢较易发病，果实上面部分呈黄色，下面部分呈绿色。通过观察染病植株叶片的亚显微结构发现，细胞结构出现明显变化。如叶绿体中淀粉粒膨大;基粒受到不同程度的破坏，呈松散状，排列比较紊乱;细胞膜凹陷形成质膜体，内部有许多形态不一的空泡;线粒体内嵴也被破坏，有的断裂不完整，有的已经消失［4］。

3 柑橘黄龙病的研究概况

3.1 病原研究

最初对柑橘黄龙病的种种推测及猜测都缺乏科学依据，直到出现病芽嫁接的相关报道，才发现该病由病毒传播引发。Doi等［5］首次在植物中发现了类菌原体病原，而Laflche等［6-7］通过用电镜观察，发现南非青果病和印度枯梢病等病株筛管的组织中也存在类菌原体，因此推测柑橘黄龙病的病源是类菌原体。然后在中国台湾发现的立枯病和菲律宾地区感染的叶斑驳病植株体内同样观察到了类菌原体。因为这种病原体的膜有3层结构，膜的厚度大概有20 nm，比类菌原体的界限膜厚得多，因此又认为，这种感染植物的病毒是一种未命名的病原菌［8］。Garnier等［9］研究发现柑橘黄龙病病原的膜结构中，内、外2层膜之间的肽聚糖与革兰氏阴性细菌的细胞壁结构十分相似，推测柑橘黄龙病的病原菌属于革兰氏阴性菌，属于变形菌门的α亚群，病原为Proteobacteria纲，韧皮部杆菌属，其形态与螺原体及菌原体不同。根据菌体的热敏感性，可分为亚洲型 (Candidatus Liberibacter asiaticus)、美洲型 (Ca．L.amercanus)、非 洲 型 (Ca．L.africanus)。柑橘黄龙病病菌很难进行人工培养。据报道，国内外均有柑橘黄龙病病菌培养成功的案例，但均被后来研究推翻，认为是假培养。

3.2 病原的检测方法

3.2.1 田间诊断

肉眼观察黄化现象，将发病植株枝条剪去，保证肥力、水分充足，外界条件正常，待新枝条长出，看是否存在黄化现象，如果存在，则证明染病，反之则没有。还可以使用指示植物，如椪柑。通过嫁接的方法将枝条接到指示苗木枝干上，每次接20株，21～23℃温室培养，大概3～4个月即可表现出症状。田间诊断法相对简单、快捷，成本小，具有多年应用历史，是目前应用最广泛的方法。因为植株叶片黄化有多种原因，所以仅靠观察黄化现象并不准确。

3.2.2 电镜观察法

在电子显微镜下观察，可以看到病菌的大小、形状及膜结构。但由于病菌分布不均匀以及采集方法不正确，通常检测准确度不高。

3.2.3 血清学鉴别法

此法需要抗体、抗原的结合，原理是依据抗体和抗原的高度特异性，由于抗体多在于血清中，所以被称为血清学反应。国内外都已制成有单克隆抗体，但是由于单克隆抗体特异性较强，只能与相应的抗原发生反应，不能与大部分的抗原发生反应，因此，该方法的应用受到很大限制。

3.2.4 PCR检测法

PCR技术高度灵敏，能检出和扩增任何仅含有一个DNA模板的样品。PCR检测法又分为4种，常规PCR、巢式PCR、定量PCR、实时荧光PCR。1999年，Hocquellet等文献对比In-2.6(M94319)和As-1.7(U09675)的rplKAJL-rpoBC基因序列设计出引物对A2和J5，分别在2种病菌中扩增出不同的片段。李韬等发现巢式PCR可以检测到单头带菌木虱。2004年，张利平［10］运用实时荧光PCR检测柑橘黄龙病病菌，发现检测精准度是常规PCR的100倍。

3.2.5 淀粉-碘反应检测

2002年，Masatoshi用组织学方法证实了感染黄龙病的柑橘叶片积累大量的淀粉粒。2002年，Onuk等［11］利用淀粉-碘反应原理对柑橘黄龙病进行了诊断。

3.2.6 高光谱检测技术

高光谱检测技术是应用高光谱图像进行物质成分检测的技术。近年来，美国科学家将高光谱技术应用到柑橘黄龙病的检测领域，旨在寻找一种快速、简便、准确的检测方法［12］。科研人员运用荧光成像光谱分析技术对柑橘健康叶子与黄龙病叶子、健康叶子与腐烂叶子、健康叶子与非黄龙病但斑驳黄化叶子进行检测，辨识率分别达为89%，87%和87%［13］。美国国家机器人工程中心科学家找到了柑橘黄龙病叶的显著光谱特征，样本采样数量足够时，正确辨识率达95%以上［14］。美国农业部科学家通过FT-IR-ATR法进行检测，正确辨识率达95%以上，并且成本低，速度快［15］。

3.3 病菌的防治

现代科技日益发达，对柑橘黄龙病的研究也日益加深，但目前对该病防治还没有十分有效的方法，截断病源传播途径、培育无毒种苗是普遍接受的方法。本文总结了比较实用、便捷的防治方法，介绍如下。

3.3.1 加强植株检查和果园管理

要尽量避免发生病害，就需要从源头截断。严格审核每个环节，严禁从发病区进行接种、换种以及育苗，也不能使携带有木虱的植株进入非病区;加强果园管理，增强树势;减少农药化肥的使用，首选有机肥料和微生物肥料，给种苗提供一个适宜的环境，增强植株抵抗力。

3.3.2 培育无菌种苗

柑橘黄龙病之所以难以防治，并且为害严重，很大一部分原因是种苗本身带毒，所以培育无菌种苗十分重要。无菌种苗培育方法又分为热处理法、珠心胚法、茎尖培养法和茎尖微芽嫁接法。柑橘黄龙病病原具有热敏感性，罗志达等［16］发现用含四环素的热水处理带病枝条比单独用热水处理效果好。高峰等［17］对华盛顿脐橙没有受精的胚珠进行离体培养，从发病植株中获得无病毒珠心苗。陈青瑛等［18-19］利用茎尖培养法获得无病毒柑橘植株。蒋元晖等［20-21］相继采用微芽嫁接技术成功培育出无病毒柑橘植株，随后，姜玲等［22］改进了柑橘微芽嫁接技术，提高了生产率。

3.3.3 培育抗性种苗

因为柑橘黄龙病防治工作颇为艰辛，有学者提出培育抗病植株，目前许多科研工作者在这方面做了大量研究工作，主要利用杂交技术、遗传转化技术、RGA基因克隆技术、转录组学和蛋白质组学技术。Shinozaki等［23］将九里香和柑橘进行体细胞杂交，但获得的杂交苗畸形，生长缓慢;美国农业部柑橘育种中心已经培育出具有一定抗性的植株［24］。遗传转化技术是通过转基因技术将抗菌肽基因导入柑橘，从而培育出抗病植株。Grosser等［25］将抗菌肽基因转入甜橙和柚子，16个月后，植株仍未出现病症。RGA基因克隆技术是目前的研究热点，但是R基因以基因簇形式存在，还难以确定目的R基因。转录和蛋白质组技术方面也做了大量研究，Martinelli等［26］通过转录组测序，发现黄龙病调控基因参与糖代谢、光合作用、细胞壁、植物激素、细胞挥发性物质合成等过程，热激蛋白表达水平的改变对柑橘黄龙病起到至关重要的作用。总之，目前抗性育种方面还不太成熟，还需要深入研究。

4 展望

从发现柑橘黄龙病至今，对柑橘黄龙病的研究一直没有停止过。因为缺乏抗生素方面的药物，目前主要以预防为主，仍然不能根治此病［27］。对发病植株最常用的方法仍然是铲除病树或者剪掉病枝，这对柑橘产业造成了很大的损失。最合理的方法是加强果园管理［28］，消灭柑橘木虱，及时挖除病树，培育无毒苗，尽早培育出抗性植株［29］。对科研工作者而言，首先应该获得病菌的纯培养，不能纯培养对柑橘黄龙病的研究造成了重大的阻碍［30］;其次应该从分子生物学方面着手，培育抗性柑橘品种。

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