阻断Hedgehog通路可抑制骨肉瘤mg63细胞的生长

陈 军吕 智*

（1 山西医科大学，山西 太原 030001；2 山西医科大学第二医院，山西 太原 030001）

阻断Hedgehog通路可抑制骨肉瘤mg63细胞的生长

陈 军1吕 智2*

（1 山西医科大学，山西 太原 030001；2 山西医科大学第二医院，山西 太原 030001）

目的 研究Hedgehog通路特异性阻断药物环靶明（cyclopamine）对人骨肉瘤细胞株mg63增殖与凋亡的影响。方法 MTT法检测环靶明对骨肉瘤mg63细胞增殖的抑制作用，流式细胞术检测细胞凋亡，PT-PCR检测环靶明处理前后Gli1、PTCH1 mRNA的表达量的变化。结果 环靶明抑制mg63细胞的增殖，并呈时间和剂量依赖性。经5、10、20 μmol/L的环靶明处理48 h后，骨肉瘤mg63细胞的凋亡率逐渐增高，明显高于对照组的凋亡率（P＜0.01）。Gli1、PTCH1mRNA在mg63中的表达实验组均低于对照组。结论 Hedgehog通路特异性阻断药物环靶明能够抑制骨肉瘤mg63细胞的增殖，促进其凋亡。

骨肉瘤；细胞增殖；细胞凋亡；环靶明

骨肉瘤是一种起源于间叶组织的骨恶性原发肿瘤，是骨骼系统最常见的原发恶性肿瘤。随着保肢手术的开展及新辅助化疗的应用，患者5年生存率提高到66%～75%［1-2］。但是近年来骨肉瘤的治疗处于平台期。Hedgehog（Hh）通路在人类胚胎的发育过程中起着重要的作用，与众多肿瘤的发生发展存在重要联系。Hh通路特异性阻断药物能够抑制由Hh通路引起的细胞反应。环靶明能与Hh通路下游分子SMO特异性结合，从而阻断Hh通路。本实验通过环靶明体外特异性阻断骨肉瘤mg63细胞中Hh通路的传导，观察对骨肉瘤细胞增殖及凋亡的影响，旨在为骨肉瘤的临床治疗提供依据。

1　材料与方法

1.1材料、试剂和仪器：骨肉瘤mg63细胞购于中科院上海生物细胞研究所。环靶明购于美国LC Laboratories公司。DMEM和胎牛血清购于武汉博士德公司。四甲基偶氮唑蓝（MTT）购自于美国Sigama公司。细胞凋亡检测试剂盒购自于北京四正柏公司。Trizol mRNA提取试剂盒购于美国Invitrogen公司。

1.2细胞培养及处理：人骨肉瘤细胞系mg63置于37 ℃、5%CO2培养箱培养。空白组，对照组，5 μmol/L环靶明组，10 μmol/L环靶明。培养48 h后检测。

1.3RT-PCR检测：收集处理48 h后各组细胞，Trizol法提取总mRNA。转录成cDNA。Gli1上游引物5-GAGATCCCACATCCTCACT-3，下游引物5-ACTTGCCAACCAGCATGCC-3，PTCH上游引物5-ATTCAACCAAACCTCTTGA-3，下游引物5-GAGTCATTAACTGGAACA-3。取cDNA及内参18S引物各2 µL进行PCR反应，计算各组ΔCt值。以公式N=2-ΔΔCt进行相对定量分析。

1.4MTT法检测mg63细胞增殖：实验组分别加入2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L环靶明（无水乙醇稀释），对照组加入等体积无水乙醇，每孔设5个副孔，48 h后MTT法测490 nm处吸光度值。另一96孔板，每孔加入10 μmol/L环靶明作用，分别在0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 d后进行MTT检测，记录各孔490 nm波长处吸光度值。重复3次。

1.5流式细胞术检测mg63细胞凋亡：每孔接种1×105个细胞。培养24 h，实验组加入5.0、10.0、20.0 μmol/L环靶明作用，对照组加入等体积无水乙醇，空白组加入等体积培养液。48 h后，AnnexinV/ PI双染色测定细胞凋亡。

1.6统计学处理：应用SPSS17.0软件处理，计量数据以（）表示，多组均数比较采用单因素方差分析，两两之间比较采用t检验，P＜0.05差异有统计学意义。

2　结 果

2.1RT-PCR：RT-PCR的检测结果显示，在骨肉瘤mg63细胞中Gli1、PTCH1均有表达，并且在环靶明浓度5.0和10.0 μmol/L的组中Gli1和PTCH1的mRNA表达均有下调。以18S作为内参，扩增Gli1和PTCH1基因，每组设3个副孔。5.0 μmol/L和10.0 μmol/L的环靶明组和对照组进行比较。结果显示环靶明组的Gli1和PTCH1基因的相对表达量均低于对照组（P＜0.05）。

2.2MTT：实验结果显示环靶明对mg63细胞有明显的抑制增殖的作用，并有一定的浓度依赖性，统计学分析显示，实验组与对照组差异有统计学意义（P＜0.01）。其中在5.0～20.0 μmol/L处抑制明显。10.0 μmol/L环靶明作用mg63细胞，随着环靶明作用时间的延长，mg63细胞的增殖能力明显下降，与对照组和空白组差异有统计学意义（P＜0.01），环靶明不同作用时间组之间差异也有统计学意义（P＜0.05）。对照组和空白组对mg63细胞增殖的作用不明显，二者之间差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3流式：随着环靶明浓度的增加，骨肉瘤mg63细胞凋亡率提高。环靶明作用48 h后，5.0 μmol/L、10.0 μmol/L、20.0 μmol/L组的细胞凋亡率分别为（6.56±0.78）%、（12.76±1.3）%、（25.63± 2.3）%，对照组细胞凋亡率为（1.32±1.2）%，组间差异有统计学意义（P＜0.01）。

3　讨 论

Hedgehog信号通路参与人类胚胎发育和胚胎形成及后期细胞分化和生长过程。于1980年由Nüsslein-Volhard C和Wieschaus E在果蝇中首先发现。其主要传导过程可概括为Hedgehog-PTCH1-SMO-Gli。近年来发现，Hh通路与肿瘤的发生发展有重要的关系。其中Gli1的活化被认为是Hh通路激活的标志。在众多肿瘤的研究中学者们发现，Hedgehog通路特异性阻断剂环靶明能够抑制Hh通路的激活，降低Gli1的表达。其主要机制可能是环靶明能够特异性结合SMO，使之失活，阻断了Hedgehog通路的传递，使Gli1不能活化。本实验以骨肉瘤mg63细胞为研究对象，通过环靶明干预mg63细胞的生长，来研究阻断Hedgehog通路对骨肉瘤mg63细胞增殖和凋亡的影响，为骨肉瘤的临床治疗提供依据。

本实验发现，Hedgehog通路在骨肉瘤mg63细胞中呈激活状态。RT-PCR显示PTCH1和SMO在骨肉瘤mg63细胞中高表达。因此作者认为，使用Hedgehog通路特异性阻断剂环靶明能够达到抑制骨肉瘤mg63细胞增殖，促进其凋亡的效果。本实验发现，环靶明作用骨肉瘤mg63细胞的生长过程，RT-PCR检测发现能够降低PTCH1和Gli1的mRNA表达。MTT检测发现，环靶明作用48h后，实验组的细胞抑制率明显增高。10.0 μmol/L环靶明作用mg63细胞，肿瘤细胞的抑制可见有明显的时间相关性。流式细胞术检测发现，随着药物浓度的提高，骨肉瘤mg63细胞的凋亡率明显增高。上述结果提示，Hedgehog通路在骨肉瘤细胞的增殖中起到维持作用，阻断该通路，可以抑制骨肉瘤mg63细胞的增殖。

对于Hedgehog通路怎样导致肿瘤发生及如何维持肿瘤增殖的机制至今仍未完全阐明。但是本实验研究证明，通过阻断该通路，可以抑制骨肉瘤mg63细胞的增殖，促进其凋亡。至于其机制，仍需对其下游基因及与Hedgehog通路相交互的其他通路做进一步的研究。本实验证实，特异性的抑制Hedgehog通路可以达到治疗骨肉瘤的目的。对于骨肉瘤的生物靶向治疗提供了依据。

［1］Link MP，Goorin AM，Miser AW，et al.The effect of adjuvant chemotherapy on relapse-free survival in patients with osteosarcoma of the extremity［J］.N Engl J Med，1986，314（25）：1600-1606.

［2］Meyers PA1，Heller G，Healey J，et al.Chemotherapy for nonmetastatic osteogenic sarcoma： the Memorial Sloan-Kettering experience［J］.Clin Oncol，1992，10（1）：5-15.

R738.1

B

1671-8194（2015）012-0043-02

山西省实验动物专项资金（项目编号：2013k01）