动脉粥样硬化血管钙化调节及中药防治研究进展

牛子冉，方莲花，杜冠华

(中国医学科学院北京协和医学院药物研究所，北京市药物靶点研究与新药筛选重点实验室，北京　100050)



动脉粥样硬化血管钙化调节及中药防治研究进展

牛子冉，方莲花，杜冠华

(中国医学科学院北京协和医学院药物研究所，北京市药物靶点研究与新药筛选重点实验室，北京100050)

摘要:血管钙化是一个与骨发育相似的过程，血管异常钙化与动脉粥样硬化以及血管顺应性降低等病变密切相关，导致血管钙化的主要原因是血管壁的钙磷过量异常沉积。血管钙化的形成受多种因素的共同调节，该文从分子机制、化学机制、代谢因素及炎症因素探讨影响血管钙化形成的因素，并对中药防治血管钙化方面的国内外研究进展进行综述。

关键词:血管钙化;动脉粥样硬化;血管平滑肌细胞;钙磷过量;调节机制;中药

血管钙化(vascular calcification)是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)、高血压、糖尿病血管病变、血管损伤和慢性肾病患者中普遍存在的临床病理表现［1］。它是一个由细胞控制而且主动可调的过程，类似骨发育和骨质疏松的过程。钙化是血管壁钙磷过量的异常沉积，可以造成斑块破裂和血栓形成，形成AS，其主要特征是动脉壁弹性降低和血流阻滞，从而降低AS的血管顺应性［2］。

血管钙化的过程是血管的管壁细胞如血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)、成纤维细胞、巨噬细胞等转变为成骨细胞样表型，是与骨发育相似的主动的、高度可调控过程。这个过程中细胞分泌多种骨形成蛋白如骨保护素、骨形态发生蛋白、骨唾液酸蛋白、骨钙蛋白等，在细胞内形成钙化［3］。这个转化的机制目前还远未阐明，是多因素参与的复杂的调节过程。目前临床心血管疾病防治的一个重要方向就是防治血管钙化。研究表明有一些中药具有防护血管钙化的作用，阐明其作用机制并研究和开发这些中药，具有重要的临床意义。

1　影响血管钙化的蛋白分子

血管钙化形成过程中有多种与骨形成相关的物质参与，有一些因子可以在钙化形成过程中激活成骨细胞的成熟，促进钙化形成。也有一些因子可以抑制VSMC转变为成骨细胞样表型的过程。

1.1促血管钙化的蛋白分子

1.1.1骨形成发生蛋白骨形成发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是转化生长因子β(TGF-β)超家族中的一员。BMP是一组与生长因子相关的蛋白，普遍存在于脊椎动物的骨骼和牙齿中，是一种高效的骨诱导因子。BMP可诱导非骨组织来源的细胞分化为成骨细胞，导致异位成骨，具有启动骨形成的巨大的能力［4］。

BMP-2基因突变小鼠在骨骼肌细胞内钙离子处理能力受损说明BMP-2可维持钙离子稳态。核心结合因子(core binding factor al，Cbfal)是成骨细胞分化的特异性转录因子，是成骨细胞分化以及软骨形成的重要因素，而在VSMC内，BMP-2可以通过调控Cbfal，控制VSMC向成骨细胞的转化。血管中膜钙化的过程是VSMC调节的细胞外基质矿物质化的结果，研究表明BMP-2同时也可以诱导VSMC外基质矿物质化［5］。

1.1.2骨钙素骨钙素(octeocalcin)又称羧谷氨酸包含蛋白类(proteins gamma-carboxyglutamic-acid-containing proteins，GLA)，具有维生素K依赖性。是由成骨细胞和成牙本质细胞特异合成和分泌的一种非胶原蛋白，是构成骨基质的成分之一［6］。绝大部分骨钙素是由成骨细胞、类似成骨细胞的钙化血管细胞分泌的，而正常VSMC分泌量极少，骨钙素是成骨细胞最终分化的特异性指标。骨钙素在VSMC中的出现，表明表达成骨细胞表型的细胞在血管钙化的发生过程中起关键作用［7］。骨钙素与羟磷灰石有很高的结合力，所以一旦发生钙沉积，就会结合于沉积的羟磷灰石。

1.1.3骨唾液酸蛋白骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein，BSP)是一种由破骨细胞和成骨细胞合成的酸性糖蛋白，是基质小泡的重要组成。BSP存在于全身血管中，是钙盐形成过程中的重要酶，可水解磷酸酯键而提高局部的磷酸根浓度，促进羟磷灰石结晶的形成［8］。因此BSP也可促进钙磷堆积，加速钙化的形成。

1.2抑制血管钙化的蛋白分子

1.2.1骨保护素骨保护素(osteoprotegerin，OPG)是肿瘤坏死因子α受体超级家族中的一员，是血管代谢和骨之间的一个连接蛋白［9］。缺乏功能性破骨细胞的OPG转基因小鼠更容易出现骨质疏松和骨折，并且在一些动脉血管壁上出现血管钙化。

OPG的生理作用可能取决于它相对于核因子κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κ B Ligand，RANKL)的水平。正常情况下，RANKL可激活它的受体RANK，这是破骨细胞成熟的必要步骤。OPG的作用类似于可溶性的诱饵受体［10］，可阻止此步骤，抑制破骨细胞的成熟。OPG被证实也可以抑制心尖瓣膜成肌纤维细胞的钙化［11］。

1.2.2基质GLA蛋白基质Gla蛋白(matrix Gla-protein，MGP)是一种骨基质蛋白，分子量很小，是维生素K依赖蛋白，可以通过γ羧基化作用进行翻译后修正。MGP在成年期骨中的表达是相对恒定的。它在正常的动脉壁细胞中也有所表达，MGP的表达在钙化后比钙化前整体上调，来抑制钙化的过程。在培养大鼠VSMC时，当细胞外钙含量增加时，MGP表达量也会增加，MGP参与一种自我平衡的调节机制来控制矿物化［12］。MGP敲除小鼠会有大量的动脉钙化，动脉血管壁会被钙化软骨代替，证明MGP可抑制钙化的形成。

1.2.3骨桥蛋白骨桥蛋白(osteopontin，OPN)是一种含有RGD的三肽序列，可以通过α-v、β-3整合蛋白绑定到细胞上，是一种重要的钙化抑制剂。它在正常人体心脏与血管中表达很低，但在AS斑块中由VSMC和巨噬细胞表达。OPN可以抑制血管软骨转化、软骨内矿物质以及胶原累积［13］。

研究发现［14］，OPN可直接抑制体外培养的牛胸主动脉VSMC的钙化，通过抑制磷矿石晶体的自我黏附和聚集，阻止其增大。通过OPN2/2/ApoE2/2模型大鼠主动脉弓上的斑块表面积和OPN在体内的含量有一定的关系，证实了OPN在AS斑块形成和发展过程中的重要作用。OPN可以减缓动脉斑块的生成和脂含量的增高，同时可降低单核细胞趋化蛋白1和白介素6的在骨髓源性巨噬细胞内的表达。

1.2.4Apelin Apelin是一种G蛋白偶联孤儿受体APJ内源性受体，是一种新型活性肽。Apelin-APJ系统是一种心血管功能的调节因子，可以介导对生理性应激以及疾病的适应性。研究显示，Apelin能通过抑制一种对基质矿物质化比较重要的酶APJ的活性来抑制钙化型VSMC的矿化过程，这个过程是通过APJ/ERK和APJ/PI3-K/Akt信号通路来抑制钙化型VSMC成骨细胞的分化来调控的［15］。

2　影响血管钙化的化学元素

在血管钙化的形成过程中，不仅受骨形成调节因子的控制，细胞内外一些金属无机盐含量的变化与钙化的形成也密切相关。

2.1钙作为与血管钙化最密切的化学因素，钙的含量可影响钙化程度。研究显示［16］，在无症状也没有慢性肾病或心血管疾病病史的健康志愿者中，通过心脏计算机断层扫描观察，钙的摄入量、血清钙水平与冠状动脉的钙化水平有密切关系。

2.2磷肾功能衰竭患者血管钙化与血清磷酸盐升高密切相关。人主动脉平滑肌细胞研究结果表明，无机磷水平过量可呈浓度依赖方式直接加重钙化，增加钙磷盐矿物的沉积量，并可促进骨钙素的表达［17］。β-甘油磷酸盐是体内有机磷供应体，可提供富含钙磷的微环境，促进钙磷盐沉积，促进细胞老化和聚合，形成多细胞结节，形成钙化。因此，在体外模拟实验中，常常用β-甘油磷酸盐来诱导VSMC的钙化。

2.3铁铁是人体新陈代谢所必需的微量元素之一，但过量的铁在人体内亦可诱导和促进AS的发生，加重患者内皮细胞损伤。铁的激活型可以参与活性氧的产生，诱导脂质过氧化反应，启动内皮激活和VSMC增殖以及巨噬细胞的活化，引起AS的发生［18］。

3　影响血管钙化的代谢因素

在代谢因素中，磷脂代谢、甲状旁腺激素和维生素D以及糖代谢都会对血管钙化的形成有一定的作用。

3.1磷脂代谢高磷酸血症在介导钙化中的重要作用主要是和慢性肾病的相关性。高磷酸血症除了在化学上促进晶体的形成，还可以在增加VSMC成骨蛋白基因的表达。血清磷水平不仅受磷酸自身、甲状旁腺激素和维生素D影响，而且受成纤维生长因子23影响。成纤维生长因子23是从骨细胞释放，通过激活它的受体，来调控磷酸盐的消除［19］。

3.2甲状旁腺激素和维生素D甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)和维生素D是调节钙磷平衡的激素。PTH分泌会使破骨细胞数量增加，促进骨的钙磷释放及基质小泡释放，高PTH水平会导致明显的钙磷代谢障碍以及钙磷水平异常。动物实验发现，高PTH水平可增加胞质中钙离子水平，促进血管中膜钙化的发生及发展。维生素D最重要的功能是维持人体钙离子代谢平衡［20］，维生素D含量增加也会加重钙化的形成。

3.3糖代谢糖尿病在临床上与血管钙化以及骨质缺乏密切相关。放射学上可检测的动脉钙化是糖尿病病人未来心血管并发症的重要标志。而在细胞水平上，在培养微血管内皮细胞时，高级糖基化末端的产生可以促进矿物质化。有研究显示，在体外培养的VSMC上，用葡萄糖可以直接促进细胞钙化，而胰岛素则可以抑制钙化［21］。

4　影响血管钙化的其它因素

血管钙化的过程除了受以上因素的影响，还可以受炎症因素、氧化应激、基质小泡和无机磷酸盐等因素的影响。

4.1炎症因素炎症和血管钙化紧密相连，巨噬细胞、淋巴细胞、树突细胞渗透斑块及其释放的细胞因子都可以调节钙化。与炎症和血管钙化之间的联系被确定的标志是肿瘤坏死因子(TNF-α)的激活，可导致Msx2-Wnt-β-catenin信号通路的级联。糖尿病高血脂大鼠中，成骨细胞前体细胞形成的上游信号通路的激活，既可以膜内骨形成过程，也可以发生在血管管壁细胞中。而且TNF-α也可以激活核转录因子NF-κB，引起血管内BMP-2表达的增加［22］。

4.2氧化应激氧化应激可以促进血管细胞的钙化，与炎症细胞因子、氧化脂质以及一些羟固醇的先导钙化有关。H2O2作为一种重要的氧化剂，可以通过上调Runx2通路促进VSMC向成骨细胞分化［23］。在人体心脏瓣膜内，活性氧的水平升高可以使钙化点位置增多。

4.3基质小泡基质小泡(matrix vesicles)主要来自内膜和中膜的平滑肌细胞。研究证实，基质小泡在软骨、骨及牙本质的钙化初始阶段起着重要作用。通过超微结构观察等方法观察人类斑块标本，发现在AS损伤处钙化中都有基质小泡的存在。斑块超薄切片分析发现，不稳定斑块纤维帽中基质小泡明显多于稳定斑块，且其中的钙沉积也比较多，进一步证明基质小泡在AS钙化中的促进作用［24］。

4.4无机磷酸盐磷酸盐水平被认为只是通过物理化学的方式来影响矿物质化，新的证据表明，磷酸盐通过动态传输过程来控制和调节细胞信号通路和基因表达。用补充无机磷酸盐的方式处理VSMC，骨调节蛋白如Cbfa-1和骨钙蛋白表达增加［25］。细胞外的磷酸盐通过钠依赖的磷酸盐载体Pit-被VSMC接纳。这样VSMC内的磷酸盐浓度增加，诱导矿物质化相关的基因。

5　中药在防治血管钙化的应用

血管钙化在AS的发生和发展中有着至关重要的作用。有研究证实［25］，维生素D3(vitamin D3)联合尼古丁(nicotine)诱导的大鼠血管钙化亚慢性动物模型。近年来有研究通过此模型表明，一些中药提取物具有防治血管钙化的作用。

5.1川芎嗪川芎嗪是从中药川芎中分离的酰胺类生物碱，为川芎的主要有效成分，具有增加冠状动脉血流量，拮抗缩血管物质的作用［26］。在维生素D和尼古丁诱导大鼠血管钙化的动物模型，以及β-甘油磷酸盐诱导的VSMC钙化模型上，川芎嗪处理后的结果显示，模型组大鼠血管和VSMC 的ALP活性增强、钙含量和钙沉积明显增强，骨桥蛋白表达水平显著降低，而川芎嗪可有效抑制整体动物和细胞的血管钙化，明显上调骨桥蛋白mRNA的表达，表明川芎嗪可能通过上调内源性钙化拮抗系统来抑制血管钙化。

5.2黄芪皂苷黄芪皂苷是传统补气中药黄芪的主要有效成分之一，具有强心、利尿、调节血压的效果。陈艳等［27］采用维生素D和尼古丁诱导大鼠血管钙化模型，诱导钙化后注射黄芪皂苷，能够明显改善模型组血管中钙含量、碱性磷酸酶活性、一氧化氮、超氧化物歧化酶等指标，减轻血管钙化程度以及组织氧化损伤。国外也有研究显示，黄芪皂苷有抑制氧化应激和细胞凋亡的作用，而氧化应激也是刺激血管钙化的一个代谢因素之一，所以黄芪皂苷对血管的保护可能与减轻氧化应激、抑制血管钙化相关。

5.3没食子儿茶素没食子酸酯绿茶及其主要提取物是没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechingallate，EGCG)，EGCG可减缓AS的形成和发展［28］，它能够抑制由血管紧张素(angiotensinⅡ，AngⅡ)诱导的c-Jun mRNA的表达，使c-Jun氨基端激酶的激活受阻，从而抑制由AngⅡ导致的VSMC钙化。

β-甘油磷酸盐诱导的VSMC钙化模型上，用EGCG干预，VSMC的碱性磷酸酶活性剂量依赖性地降低。EGCG减轻细胞钙超负荷，降低细胞钙化程度，证明EGCG具有抑制VSMC钙化的作用［29］。

6　结语与展望

血管钙化在临床上是AS的标志，可能也是慢性炎症将周围软组织钙化的特异性因子。血管钙化的形成是一个与骨发育相似的可调控的过程。血管的管壁细胞在一定条件下可转变为成骨细胞样表型，分泌多种骨形成蛋白，调控多条通路，形成血管钙化。血管钙化是多因素参与的复杂的调节过程，受代谢、化学以及炎症等多种因素的调控。

上述的川芎嗪、黄芪皂苷和EGCG分别是中药川芎、黄芪以及绿茶的有效成分，有关研究已表明，它们在防治血管钙化进而在防治AS方面具有良好的作用。深入阐明血管钙化的调节因素以及这些中药在抑制血管钙化的作用及其机制对于有效利用这些传统中药具有重要意义，将为防治血管钙化，以及保护心血管系统提供广阔的应用前景。

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Research progress of regulating mechanism of vascular calcification in the atherosclerosis and preventive effect of traditional Chinese medicine

NIU Zi-ran，FANG Lian-hua，DU Guan-hua
(Beijing Key Laboratory of Drug Targets Identification and Drug Screening，Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100050，China)

Abstract:Vascular calcification is a process similar to bone development，which is excessively abnormal deposition of calcium and phosphate in blood vessel wall.It is a sign of early atherosclerosis formation，and can reduce the atherosclerotic vascular compliance.The common regulation of vascular calcification is affected by many factors.This article discusses the formation of vascular calcification from the molecular mechanism，the chemical mechanism and metabolic factors.It also reviews the progress of the prevention of vascular calcification by traditional Chinese medicine.

Key words:vascular calcification; atherosclerosis; vascular smooth muscle cell; calcium phosphate overdose; regulatory mechanism; traditional Chinese medicine

作者简介:牛子冉(1991－)，女，硕士生，研究方向:心脑血管药理学与新药发现，Tel: 010-63131571，E-mail: niuzr@ imm.ac.cn;方莲花(1963－)，女，博士，研究员，博士生导师，研究方向:心脑血管药理学与新药发现，通讯作者，Tel: 010-63165313，E-mail: fanglh@ imm.ac.cn;杜冠华(1956－)，男，博士，研究员，博士生导师，研究方向:神经药理学与新药发现，通讯作者，Tel: 010-63165184，E-mail: dugh@ imm.ac.cn

基金项目:国家科技部“重大新药创制”科技重大专项(No 2013ZX09103001-008，2012ZX09103101-078)

收稿日期:2015－03－08，修回日期:2015－04－07

文献标志码:A

文章编号:1001－1978(2015) 06－0741－04中国图书分类号: R-05; R322.12; R322.74; R349.21; R543.505.31

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.001