酶联免疫吸附试验定量检测血清肝素酶方法的应用价值

朱 妍朱 叶于 蕾郭海燕*

（1 长春医学高等专科学校基础医学部中心实验室，吉林 长春 130031；2 长春市中心血站血液检测实验室，吉林 长春 130000；3吉林省肿瘤医院，吉林 长春 130012）

酶联免疫吸附试验定量检测血清肝素酶方法的应用价值

朱 妍1朱 叶2于 蕾3郭海燕3*

（1 长春医学高等专科学校基础医学部中心实验室，吉林 长春 130031；2 长春市中心血站血液检测实验室，吉林 长春 130000；3吉林省肿瘤医院，吉林 长春 130012）

目的 通过酶联免疫吸附试验定量检测血清肝素酶，对肿瘤患者及健康患者的血清肝素酶进行比对分析，探讨此种方法的应用价值。方法 分别选取50名健康患者和50例肿瘤患者的血清，通过双夹心免疫吸附试验的方法，检测其肝素酶水平。结果 通过检测血清中肝素酶D450nm值，由结果显示肿瘤患者要大于健康患者。结论 酶联免疫吸附试验可以辅助临床对肿瘤疾病进行诊断，而且方法可靠，灵敏度高，有较高临床价值，值得推广应用。

酶联免疫吸附试验；血清肝素酶；定量检测；应用价值

肝素酶是可以使肝素及乙酰肝素分子的多糖裂解的一种内源性的β-葡萄糖苷内切酶。它既包括微生物裂解肝素及硫酸乙酰肝素，也包含动物体内通过水解产生内源性的硫酸乙酰肝素酶类。肝素酶能够特异性辨识乙酰类肝素多糖上的硫酸肝素侧链，从而破坏细胞及血管的完整性，发挥相应的作用，而且可以使存在其侧链上的生长季趋化因子及酶分子等有活性物质进行释放，这在肿瘤的出现及发展的进程中起到相关的作用。近些年来，通过免疫等手段进行肝素酶表达的检测，可以得出包括白血病在内的恶性肿瘤患者，检测其体内肝素酶的水平及活性程度，均比健康人的值要高，尤其是肿瘤处于转移阶段，其值明显增高。这一病理现象可以帮助临床采取相应手段进行肿瘤辅助的诊断。但就目前的研究状况，没有统一标准的相应检测试剂，但就免疫组化等检测方法相对比，对患者采用血清肝素酶辅助判断疾病，对机体伤害相对较小，操作也相对简便，为此，摸索出既简单灵敏度又高的肝素酶检测方法对国内肝素酶的探讨及研究具有十分重要的意义［1］。本组就针对2013年7月至2014年7月，健康患者和肿瘤患者的血清各50例，通过双夹心免疫吸附试验的方法，检测其肝素酶水平，其临床资料如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料：本组选择在2013年7月至2014年7月，通过临床检查确诊为肿瘤的患者50例，进行肿瘤标志物进行筛查是阴性，其中男性28例，女性22例，年龄在32～66岁，平均年龄49岁。肺癌21例，胃癌14例，肝癌15例。选取健康的志愿者50名，其中男性27名，女性23名，年龄36～69岁，平均年龄52.5岁，经过检查健康状况良好，经过其同意可以进行接下来的检测。获得的样品均当天采集后进行离心处理。

1.2 双夹心免疫吸附试验步骤

1.2.1 制备过程：将鼠的抗肝素酶单克隆抗体包被于pH值为9.6的Na2CO3-NaHCO3的缓冲溶液中，从中取出50 μL的液体置于96孔酶标板中，在4 ℃条件下放置18 h，并用pH值为7.4的磷酸缓冲溶液反复冲洗干净，置于有20 g/LBSA的磷酸盐缓冲液进行96孔酶标板封闭1 h，随后反复冲洗3～5次后，处于4 ℃环境下保存待用。

1.2.2 反应过程：在96孔酶标板中分别加入200 μL的血清样品，相同血清样品重复做三个，在室温环境下放置2 h，随后反复冲洗5次后，在向其中加入兔的抗肝素酶多克隆抗体100 μL，处于室温环境下放置2 h，反复冲洗5次。将100 μL稀释到20000倍的HRP标记羊抗兔IgG置于酶标板微孔中，在室温环境下放置1 h，最后加入TMB显色底物50 μL放置半个小时，随后用硫酸100 μL结束反应进程。在D450 nm及D603 nm条件下应用酶标仪进行检测。

1.2.3 酶联免疫吸附试验方法及其作用原理。①酶联免疫吸附试验的基本原理：酶和相应的抗体及抗抗体分子进行共价结合，共价键的结合特点就是不影响及改变抗体的免疫学性质，对生物学性质也不产生妨碍。被酶标记抗体可以和被吸附在相应载体上的抗原抗体进行连接。在上述溶液中加入底物，酶可以使底物的没有颜色的还原型的供氢体转变成有颜色的氧化型的状态，呈现出颜色的变化来反应体系的进程。为此可观察反应体系的颜色变化来判断免疫反应是否发生。在反应体系中，呈现出的颜色深浅程度和样品中的抗体抗原的量有关，相应的抗原抗体量多，反应的颜色就较深。这种颜色深浅的变化可以通过酶联免疫吸附试验的检测仪器来定量测定检测［2］。②酶联免疫吸附试验，在免疫技术中应用广泛，其常用方法有双抗体夹心法及间接法，双抗体夹心法主要应用于分子量大的抗原检测，间接法多用于特异性抗体的测定。双抗体夹心法主要分为四个步骤，首先要进行特异性的抗体和载体想结合，反复洗涤去除杂质，然后加入需要检测的样品，并使之平衡一段时间，目的是使样品中的抗原和相应的抗体结合上，同样需要洗涤掉未结合的抗体以及杂质等。第三步需要加入酶标物，使上述免疫结合物的抗原和酶标物进行连接，同样进行洗涤的步骤清除杂质。酶量和样品中的要进行检测的物质量有关系。最后将底物反应变成有色的物质，并根据颜色的深浅程度对进行定量判断［3］。

1.4 统计学处理：选用SAS统计软件分析处理实验数据，对每个样品的3个重复实验计算平均值及标准偏差，对稳定性进行评估。分析健康患者血清D值的状况，肿瘤患者血清D值的状况，对两组的血清肝素酶的水平进行对比，比较其差异水平，确定此种方法对血清肝素酶的检测对辅助肿瘤的临床价值。

2 结 果

对每个样品平行测定三次进行平均值的计算，并计算微孔间的标准差都＜0.019，且相对标准偏差也要＜9.0%，从统计结果来看检测方法稳定，可靠。经过数据处理：50名健康志愿者的血清肝素酶的D值呈现正态分布趋势，其平均值是0.094，处于95%置信区间内其范围在0.067～0.106。50例肿瘤的患者，血清肝素酶的D值也呈现正态分布趋势，平均值是0.178，处于95%置信区间内其范围在0.152～0.191。经两组数据进行比较，存在显著性差异，通过对血清肝素酶D值的检测，肿瘤患者的D值要比健康志愿者的D值明显增高。

3 讨 论

肝素酶和肿瘤的产生及变化有着密切的关系，尤其肿瘤处于转移阶段的患者体内肝素酶的水平和肿瘤的动态变化息息相关。为此，对肿瘤患者血清肝素酶的有效检测，可以辅助肿瘤的诊断，用于评价其恶化程度。但就目前的研究状况来说，因为血清中的肝素酶的存在量很低，而且又存在特异性的免疫性质，反应性好的抗体价格很高，限制了此种方法的发展。现在，在国内及国外市场上并没有相应的检测试剂盒，相关的研究报道也很少见。因此，研究一个可以有效的检测血清肝素酶的办法对肝素酶的发展起到很重要的作用［4］。搭建灵敏度高，重现性好的酶联免疫吸附试验第一个需要解决的问题就是筛选出适合的抗体，本研究综合考虑了实验准确率及成本的因素，最终筛选出用鼠抗肝素酶单克隆抗体及兔抗肝素酶多克隆抗体，并采用双抗体夹心法进行先关研究，最后得到的结果稳定好，重现性也较好。和别的检测方法比较，此种检测方法具有材料选择简便，操作简单的优点，而且定量精准，可以影响定量的因素少，对于免疫组化及原位PCR等方法，会因为选取的部位不同，选取的样品大小不一或是人为的一些因素对检测的结果影响很大，此两种方法需要在患者的身体上得到肿瘤的样本或是一些癌症组织，进行这样的处理给患者的身体及心理上造成很大影响，产生较大负担。采取双抗体夹心法不仅不会给患者带来身体上的伤害及心理上的负担，还在准确及重现性上体现出自身方法的优点。最重要的是双抗体夹心方法操作简单易学，可以动手完成也可以用仪器机械化完成，更有利于肿瘤的筛查。本组对50例肿瘤患者的血清肝素酶水平进行检测，其水平值显著高于健康志愿者的血清肝素酶水平值，这一结果和国外对血清肝素酶水平的研究结果趋势相同，这一结果可以在一定程度上说明可以选择血清肝素酶代替组织肝素酶的检测。

酶联免疫吸附试验是到目前为止使用最广的一项技术，特异性的将抗原抗体相结合，并使之酶的催化底物进行有效的结合起来，检测血清中微量的肝素酶，在操作的过程中需要对样品进行采集、保存，准备相应的试剂，随后进行加样品，显色比色等步骤，如果其中一个步骤出现人为的操作问题都会影响结果的准确性。显色这一步骤对酶联免疫吸附的方法得到的结果影响较大。目前来讲，常用的测定显色物质是四甲基联苯胺及过氧化氢，在辣根过氧化物酶的作用下，产生颜色的变化。所以，目前把研究重点放在肿瘤患者血清肝素酶水平上的研究是十分有意义的，可以评估患者肿瘤的变化情况，为临床的诊断提供了很好的参考和有力的依据。

［1］ 田曙光，虞立霞.酶联免疫吸附试验定量检测血清肝素酶方法的建立及应用［J］.生物技术通讯，2009，20（4）:545-546.

［2］ 王晓秋.酶联免疫吸附试验在蛋白质/多肽类药物药代动力学研究中的应用［J］.中国药理学与毒理学杂志，2013，27（3）:534-535.

［3］ 尹利民.动力学法在酶联免疫吸附试验定量检测中的应用［J］.检验医学与临床，2012，9（7）:852-853.

［4］ 李颖，黄永升.比色时间与存放温度对酶联免疫吸附试验结果判读的影响［J］.检验医学与临床，2011，8（4）:450-452.

R446.6

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1671-8194（2015）13-0097-02