亚甲基四氢叶酸还原酶多态性与早期妊娠丢失风险的关系研究

杨文方，樊 静，李丹阳，王 翔，姚 屹，王加丽，曾令霞，于学文，张昌宁

(1.西安交通大学第一附属医院，陕西 西安 710061；2.中国疾病预防控制中心妇幼保健中心，北京 100081；3.西安交通大学医学部，陕西 西安 710061；4.西安市卫生和计划生育委员会，陕西 西安 710021)

亚甲基四氢叶酸还原酶多态性与早期妊娠丢失风险的关系研究

杨文方1，樊 静1，李丹阳1，王 翔1，姚 屹2，王加丽1，曾令霞3，于学文1，张昌宁4

(1.西安交通大学第一附属医院，陕西 西安 710061；2.中国疾病预防控制中心妇幼保健中心，北京 100081；3.西安交通大学医学部，陕西 西安 710061；4.西安市卫生和计划生育委员会，陕西 西安 710021)

目的 探讨亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T位点多态性与早期妊娠丢失风险的关系。方法 采用PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测232例妊娠13+6周之内曾有不良孕史及先兆流产史的患者(病例组)和369例孕前检查的正常妇女(对照组)MTHFRC677T基因多态性。结果 不良孕史及先兆流产史患者MTHFRC677T位点3个基因型多态性与对照组有显著性差异(χ2=37.768，P<0.05)；与CC基因型个体相比，TT 基因型的个体发生早期妊娠丢失的风险高达3.596倍(OR=3.596，95%CI: 2.232～5.794)，CT基因型的个体发生早期妊娠丢失的风险为3.277倍(OR= 3.277，95%CI: 2.137～5.026)。病例组T等位基因频数分布显著高于C 等位基因频数分布(57.1% vs. 40.1%，χ2=33.094，P<0.05,OR=1.988，95%CI: 1.571～2.517)。结论 MTHFR C677T突变可能是早期妊娠丢失的遗传易感性因素。

亚甲基四氢叶酸还原酶；基因多态性；不良孕史；先兆流产史

亚甲基四氢叶酸还原酶(methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR)是叶酸和同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)代谢的关键酶，与DNA甲基化和合成密切相关。MTHFR基因的突变会引起酶活性有所降低，结果使叶酸水平降低，血浆Hcy浓度升高，导致一系列病理的改变引发代谢综合征[1]。妊娠期高同型半胱氨酸血症已是许多妊娠相关疾病的一个独立危险因素，如神经管缺陷、胎盘早剥或血栓栓塞、子痫前期和不明原因的复发性流产等[2]。本研究采用PCR-限制性片段长度多态性方法检测西安交通大学第一附属医院优生门诊就诊患者 MTHFRC677T基因多态性，以探讨其与早期妊娠丢失风险的关联性。

1 临床资料及方法

1.1 资料来源

按知情同意原则，选择收集2013年3月至2014年7月西安交通大学第一附属医院优生门诊就诊，曾经在妊娠早期有过不良孕史和先兆流产史的患者232例为病例组，年龄为20～43岁，平均年龄(28.41±3.62)岁；随机选择同期正常孕前检查者(经临床检查排除自然流产史、早产史、宫内死胎和妊娠高血压疾病等病史)369例为对照组，年龄为20～42岁，平均年龄(28.75±3.69)岁。所有研究对象均来自西北地区，年龄为20～43岁，平均年龄(28.62±3.66)岁。病例组和对照组之间，年龄无显著性差异，具有可比性(t=1.108，P>0.05)。

1.2 病例组的纳入和排除标准

妊娠早期不良孕史：在妊娠13+6周内，至少曾经发生过一次自然流产、稽留流产(包括复发性流产)。排除夫妇染色体异常、子宫畸形、宫颈机能不全。

妊娠早期先兆流产史：在妊娠13+6周内，曾确诊为先兆流产，但经过治疗后，继续妊娠超过13+6周。

1.3 实验方法

抽取患者空腹外周静脉血2mL于EDTA抗凝管中待提取DNA。用人全血DNA提取试剂盒(上海百傲科技股份有限公司)提取DNA后，存放于-20℃冰箱用作下一步实验。MTHFR基因型测定采用PCR-芯片杂交显色试剂盒(上海百傲科技股份有限公司)检测MTHFR基因型。PCR扩增引物序列如下:上游5'-CAAAGGCCACCCCGAAGC-3'和下游5'-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3'，反应体系25μL:1mmol/L MgCl2、dNTP200μmol/L、正反引物各0.5 μmol/L、TaqDNA聚合酶2 U、模板DNA5 μg。PCR扩增条件如下:94℃5min，94℃30s，56℃40s，72℃40s，35个循环，末次延伸5min。取10uLPCR反应产物进行杂交显色，然后用芯片识读仪读取患者基因型。

1.4 统计学处理

采用SPSS 18.0软件进行统计分析，计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验，基因频率采用基因计数法计算，以P<0.05为具有统计学显著性意义。

2 结果

2.1 研究对象的亚甲基四氢叶酸还原酶分布频率

MTHFR基因多态位点3种基因型在对照组和病例组之间的分布频率不同，差异有统计学意义(χ2=37.768，P<0.05)，见表1。病例组T 等位基因频数分布与C 等位基因频数分布见表2。

表1 对照组与病例组MTHFR C677T基因型频率与等位基因频率的分布[n(%)]

Table 1 Genotypic and allelic frequencies of MTHFR C677T between case group and control group [n(%)]

表2 对照组与病例组MTHFR C677T等位基因频率的分布[n(%)]

Table 2 Allelic frequency of MTHFR C677T between case group and control group [n(%)]

2.2 亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与早期胚胎丢失的关系

表1结果提示，MTHFR基因位点多态性和不良孕史及先兆流产史显著相关。TT基因型的个体发生早期妊娠丢失的危险度显著增高，是CC基因型个体的3.596倍(OR=3.596，95%CI: 2.232～5.794)，CT基因型是CC基因型个体的3.277倍(OR=3.277，95%CI: 2.137～5.026)。TT与CT 基因型频数比较差异无显著性(χ2=0.205，P=0.651)。表2结果提示，T 等位基因是不良孕史及先兆流产史发生的危险因素，病例组T等位基因频数分布显著高于C 等位基因频数分布(57.1% vs. 40.1%，χ2=33.094，P<0.05,OR=1.988，95%CI: 1.571～2.517) 。

3 讨论

3.1 亚甲基四氢叶酸还原酶缺陷是神经管缺陷及不明原因妊娠丢失的危险因素

血液高凝状态与不良孕史和先兆流产史的发生密切相关。高同型半胱氨酸血症易造成血管内皮损伤，导致血栓形成，是近年发现的血液高凝状态形成的重要原因之一。Hcy代谢酶的基因突变引起缺陷或活性下降从而导致Hcy升高。人类的MTHFR基因位于染色体1p36.3，整个编码区长1 980bp，包含11个外显子，长度从102～432bp不等，内含子250～1.5kb，MTHFR是在同型半胱氨酸甲基化代谢途径中起关键酶作用。MTHFR催化5，10-亚甲基四氢叶酸生成5-甲基四氢叶酸，从而使甲基转移至钴胺素，生成的5-甲基四氢叶酸可以为同型半胱氨酸提供甲基形成蛋氨酸。MTHFR C677T基因有3种基因型：CC是正常或野生型，CT是杂合子，TT是突变型。目前研究发现，MTHFR基因第4外显子的C677T碱基突变最为常见，MTHFR基因第677 位密码子胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)置换，从而使一个高度保守的丙氨酸(Ala)变成了缬氨酸(Val)，使MTHFR活性降低，并产生不可耐热性，从而引起Hcy在血浆中的蓄积[3]。低叶酸和高同型半胱氨酸水平与妊娠并发症如低出生体重婴儿、早产、先兆子痫、死胎、以及反复妊娠丢失有关。它们也与先天性畸形，如神经管缺陷、马蹄内翻足、心脏缺陷、肢体缺陷、唇腭裂、和唐氏综合征7相关[4]。近几年研究者发现流产发生的一个重要原因与蜕膜绒毛缺血性坏死有关[5]。

3.2 MTHFR基因多态性与早期妊娠丢失的关系特点

钟慧军等[6]研究发现，中国宁夏地区汉族人口MTHFR677C→T突变与复发性流产危险性之间有相关性，带有TT基因型的个体发生复发性流产的危险度明显增高，是CC基因型个体的8.44倍。病例组T等位基因频率高于C等位基因频率，差异具有显著性。张家颖等[7]研究发现，病例组MTHFR C677T 位点CC、CT 和TT基因型频数与对照组比较差异具有显著性，TT与CC基因型频数分布比较差异具有显著性，TT 与CT 基因型频数比较差异无显著性，病例组T 等位基因频数与C等位基因频数比较差异具有显著性。本研究结果发现，MTHFR基因多态位点3种基因型在对照组和病例组之间的分布频率不同，差异有统计学意义(P<0.05)。带有TT基因型的个体发生早期妊娠丢失的危险度增高，是CC基因型个体的3.596倍(OR=3.596，95%CI: 2.232～5.794)。CT基因型是CC基因型个体的3.277倍(OR=3.277，95%CI: 2.137～5.026)。但是TT与CT 基因型频数比较在病例组与对照组之间无显著性差异(P>0.05)。病例组T 等位基因频数分布与C 等位基因频数分布比较差异有显著性(P<0.05)，与钟慧军等[6]及张家颖等[7]报道的结果一致。本文已确诊的不良孕史和先兆流产史患者与正常孕前检查者进行对比分析，结果表明不良孕史和先兆流产史患者突变等位基因频率与纯合突变基因型频率均明显高于对照组，证明亚甲基四氢叶酸还原酶基因的多态性可能是早期妊娠丢失的一个遗传风险因素，值得进一步研究。

[1]Yang B, Fan S, Zhi X,etal. Associations of MTHFR C677T and MTRR A66G gene polymorphisms with metabolic syndrome: A case-control study in Northern China[J]. Int J Mol Sci, 2014, 15(12): 21687-21702.

[2]Cao Y, Zhang Z, Zheng Y,etal. The association of idiopathic recurrent early pregnancy loss with polymorphisms in folic acid metabolism-related genes[J].Genes Nutr,2014, 9(3): 402.

[3]Anderson C A, Beresford S A, McLerran D,etal. Response of serum and red blood cell folate concentrations to folic acid supplementation depends on methylenetetrahydrofolate reductase C677T genotype: results from a crossover trial[J].Mol Nutr Food Res, 2013, 57(4): 637-644.

[4]Summers C M,Mitchell L E, Stanislawska-Sachadyn A,etal. Genetic and lifestyle variables associated with homocysteine concentrations and the distribution of folate derivatives in healthy premen opausal women[J].Birth Defects Res A Clin Mol Teratol, 2010, 88(8): 679-688.

[5]白慧健,马太芳,李钊,等.胚胎血红蛋白基因变异与自然流产的相关性研究[J].吉林医学,2011,32(36):7689-7690.

[6]钟慧军,刘军红,朱永生,等.MTHFR C677T基因多态性与复发性自然流产的相关性研究[J]. 宁夏医学杂志,2010,32(8):675-676.

[7]张家颖,左文静,武广恒,等.MTHFR 基因C677T 多态性与习惯性流产的关联性分析[J]. 吉林大学学报(医学版),2009,35(4):698-701.

[专业责任编辑：韩 蓁]

Association between MTHFR C677T and risk of early pregnancy loss

YANG Wen-fang1, FAN Jing1, LI Dan-yang1, WANG Xiang1, YAO Yi2, WANG Jia-li1, ZENG Ling-xia3, YU Xue-wen1, ZHANG Chang-ning4

(1.FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,ShaanxiXi’an710061,China;2.ChineseCenterforDiseaseControlMaternalandChildHealthCenter,Beijing100081,China;3.HealthScienceCenter,Xi’anJiaotongUniversityShaanxiXi’an710061,China;4.Xi’anHealthandFamilyPlanningCommission,ShaanxiXi’an710021,China)

Objective To discuss the relationship between methylene tetrahydrofolate reductase (MTHFR) C677T and early pregnancy loss risk. Methods PCR-RFLP method was used to detect the MTHFRC677T gene polymorphism of 232 patients with adverse pregnant history or threatened abortion history within 13+6week (case group) and 369 normal women checked before pregnancy (control group). Results There was significant difference in the polymorphism of three genotypes of MTHFRC677T site between case group and control group (χ2=37.768，P<0.05). The risk of early pregnancy loss among the patients with TT gene type significantly increased and reached to 3.596 times compared with CC gene type (OR=3.596， 95%CI: 2.232-5.794), and that among patients with CT gene type showed 3.277 times (OR= 3.277，95%CI: 2.137-5.026). The allelic frequency of T was significantly higher than C in case group (57.1% vs 40.1%，χ2=33.094，P<0.05,OR=1.988，95%CI: 1.571-2.517). Conclusion MTHFR C677T mutation might be the genetic susceptibility factor leading to early pregnancy loss.

methylene tetrahydrofolate reductase (MTHFR); gene polymorphism; adverse pregnant history; threatened abortion history

2015-12-02

中国疾病预防控制中心妇幼保健中心资助项目(2015FYJ002)；西安市卫生和计划生育委员会资助项目(HX201549)

杨文方(1972-)，女，副主任医师，主要从事优生与出生缺陷研究工作。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.06.007

R714.2

A

1673-5293(2015)06-1128-03