探索运用流式细胞仪来检测细胞凋零的方法

李青鞠

（河南省濮阳市濮阳油田总医院检验科，河南 濮阳 457001）

探索运用流式细胞仪来检测细胞凋零的方法

李青鞠

（河南省濮阳市濮阳油田总医院检验科，河南 濮阳 457001）

目的 探讨运用流式细胞仪来检测细胞凋零的方法。方法 以流式细胞仪检测细胞的DNA含量、磷酯酰丝氨酸、线粒体膜电位、钙离子浓度，对凋零细胞的特点进行分析。结果 DNA含量检测敏感度、特异性欠佳；磷酯酰丝氨酸测定对细胞凋零的早期、晚期情况可做出良好反应；线粒体膜电位、钙离子浓度可反应出细胞凋零时的生理指标。结论 每种检测方法均存在一定的优缺点，在使用流式细胞仪检测细胞凋零时，应具有针对性的检测方法进行选择，提高检测效率。

流式细胞仪；细胞凋零；DNA含量；磷酯酰丝氨酸；线粒体膜电位

细胞凋零又称为细胞程序性死亡，细胞凋零时，往往伴有形态变化及生化改变。了解细胞凋零过程对于维持机体的正常发育、促进新陈代谢是具有重要意义的，细胞凋零是具有一项正向意义的机体内部活动［1］。但由于细胞凋零与细胞坏死之间存在大量的相似点，因此，了解一个细胞具体的凋零过程是十分有必要的。目前，常通过流式细胞仪来检测细胞凋零的过程，该种仪器可对细胞进行定量分析和分选。在此次调查中，笔者主要从测定DNA含量、磷酯酰丝氨酸、线粒体膜电位、钙离子浓度等方面来了解细胞凋零过程中所发生的一系列生化改变特性，并筛选出检测细胞凋零的最适方法。具体情况如下。

1　材料与方法

1.1试验材料：人脐静脉内皮细胞由上海博古生物提供，脂多糖由Sigma公司生产提供，Annexin V-FITC/PI细胞凋零检测试剂盒由Roch公司生产提供，JC-1、罗丹明123膜电位检测试剂盒由碧云天公司生产提供，Fulo-3钙离子浓度检测试剂盒由碧云天公司生产提供。

1.2细胞培养方法：此次试验主要通过DMEM/F12培养基对细胞进行培养，使细胞贴壁生长直至融合。细胞消化传代使用1.25 g/L胰酶，并从中选择生长良好的人脐静脉内皮细胞进行试验。

1.3实验组与对照组的设定：实验组细胞中加入20 mg/L的LPS，并对细胞进行一段时间的刺激。对照组细胞中不加入药物，使两组细胞的最终培养浓度为5×105个/mL。

1.4试验方法

1.4.1DNA含量测定：以PBS对胰酶消化细胞进行洗涤，通常洗涤2次，后收集细胞。加入预冷70%的乙醇溶液，于4 ℃恒温环境下放置过夜。离心法收集所需细胞，并加入50 μg/mL的溴化乙锭及100 μg/mL的RNaseA，在4 ℃环境中避光培养30min后以流式细胞仪进行细胞检测。

1.4.22磷脂结合蛋白AnnexinV-FITC/PI检测法：以PBS对胰酶消化细胞进行洗涤，通常洗涤2次，后收集细胞。于细胞内加入经FITC所标记的AnnexinV，并在室温环境下避光培养30min。后加入PI，于避光环境下再次培养反应5min。最后加入Buffer（加入量根据细胞量确定）并以流式细胞仪进行细胞检测。

1.4.3线粒体膜电位检测：以PBS对胰酶消化细胞进行洗涤，通常洗涤2次，后收集细胞。以浓度为1mol/L的Rhodamine对细胞进行染色，于37 ℃环境下放置30min，使得细胞染色均匀，而后通过流式细胞仪进行细胞检测（进行细胞荧光强度检测）。

1.4.4钙离子浓度检测：以PBS对胰酶消化细胞进行洗涤，通常洗涤2次，后收集细胞。细胞内加入5μmol/L的Flou-3-AM，并在37 ℃恒温条件下进行负载至Flou-3进入至细胞内部。对于未负载成功的荧光探测剂进行洗涤，并通过流式细胞仪对细胞进行检测。

2　结 果

2.1DNA含量检测结果：细胞发生凋零时，可激活核酸内切酶，致死DNA出现断裂。以PI对细胞进行染色，可显示出“亚二倍峰”，及所谓的凋零峰。通过凋零峰，可对细胞凋零的百分率进行计算。在此次试验中，实验组与对照组应存在LPS刺激的差异，可见实验组DNA断裂的发生率明显高于对照组。因此，可通过DNA含量检测来确定细胞凋零率。

2.2磷脂结合蛋白AnnexinV-FITC/PI检测法检测结果：在细胞凋零早期，细胞膜可发生重排反应。重排反应可使得磷酯酰丝氨酸由细胞膜内侧翻转至细胞膜表面。AnnexinV可与翻转至细胞外部的磷酯酰丝氨酸相结合，反应细胞早期凋零时的情况。而PI中晚期凋零细胞及死亡细胞进行染色反应，PI作为核酸染料，可直接穿透细胞膜对细胞核进行染色，使其细胞核呈红色。因此，可通过AnnexinV-FITC/PI区分细胞的早、中、晚及死亡期。

2.3线粒体膜电位检测检测结果：当膜电位下降时，可表示细胞处于凋零早期。当线粒体膜电位较低时，JC-1以单体形式存在。经检测，此时其所激发的波长为488 nm、发射的波长为529 nm，所呈现出的为绿色荧光。当线粒体膜电位较高时，JC-1以聚合体形式存在。经检测，此时其所激发的波长为490 nm、发射的波长为590 nm，所呈现出的红橙色荧光。因此，可通过线粒体膜电位的检测结果反映出细胞凋零早期。此次试验中，实验组细胞荧光显示逐渐由红橙色转变为绿色。

而罗丹明123染料是一种线粒体跨膜电位指示剂，其可直接透过细胞膜。当细胞正常时，罗丹明123染剂可通过线粒体跨膜电位直接进入线粒体机制，使得荧光强度明显减弱或消失。当细胞发生凋零时，线粒体膜可受到破坏，并可重新释放出线粒体，荧光强度增加，并主要放射出黄绿色荧光。可见，罗丹明123染料检测也可直接反映出细胞凋零的情况。此次实验组细胞黄绿色荧光强度明显增加。

2.4钙离子浓度检测结果：Flou-3-AM不能与游离于细胞外的Ca2+相结合，但其进入细胞后，其可脱去“-AM”。形成脂溶性的Flou-3，Flou-3可与细胞内游离的钙离子相结合，并可释放出高于本身40倍左右的荧光强度。因此，通过Flou-3-AM检测，可有效区分细胞内外的钙离子含量。当细胞发生凋零时，细胞外的Ca2+会出现内流情况，使得细胞内的Ca2+含量明显的增多。此次实验组的细胞的黄绿色荧光强度明显增加。

3　讨 论

对于细胞凋零检测，每种检测方法均存在一定的局限性，如DNA含量检测法，仅可反应细胞的凋零率，而并不能反应出细胞的凋零阶段，其检测特异性欠佳［2］。因此，在进行细胞凋零检测时，需进行针对性的方法选择，提高检测效率。笔者对每种检测方法的缺点进行一定的总结，具体如下［3-4］：①DNA含量检测。DNA含量检测特异性较低，除了凋零细胞外，机械损伤性细胞或本身细胞内DNA含量就较低的细胞均可出现凋零峰，因此，单独的DNA含量检测并不能确定细胞为凋零细胞。②Annexin-V-FITC/PI检测法。该种检测方法可对细胞凋零的分期阶段进行显示，但却无法分辨出凋零或坏死的细胞，由于坏死细胞的细胞膜通透性也明显的增强，因此，在进行检测时需控制凋零细胞及坏死细胞的比例。③线粒体膜电位检测。细胞凋零与膜电位下降呈正相关关系，这是一个不可逆转的过程。④钙离子浓度测定。钙离子内流的情况不仅仅在于发生细胞凋零，其检测结果易受到外界环境因素的影响。

总之，结合多种方法进行细胞凋零检测，可明显提高检测准确度。同时，在进行检测前对检测方法进行针对性的选择，可有效提高检测效率。

［1］ 顾芳，秦宜德，罗欣，等.细胞凋亡检测方法的研究进展［J］.医学信息，2014，32（10）：517-518.

［2］ 孙建平，谭竹钧，韩雅莉，等.细胞凋亡检测方法的研究进展［J］.生物技术通报，2012，（1）：54-59.

［3］ 高枫.细胞凋亡检测方法及其研究进展［J］.陕西医学杂志，2013，42（8）：1082-1083.

［4］ Yu S，Deng G，Qian D，et al Detection of apoptosis-associated microRNA in human apheresis platelets during storage by quantitative real-time polymerase chain reaction analysis［J］. Blood Transfus，2014，12（4）：541-547.

R329.2

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1671-8194（2015）10-0077-02