不同来源脂肪酶抗逆性的对比研究

■米 雁 朱琳娜 蔡青和 陈国营 程媛媛

(上海欧耐施生物技术有限公司，上海201606)

脂类是能量含量最高的营养素，20世纪50年代，国内外已将脂类物质用于家禽饲料中，但是随着动物日粮中脂类物质添加量的增加，饲料颗粒变软，质量下降，粗脂肪利用率下降。脂肪酶属于消化酶，又称三酰甘油酰基水解酶，不仅催化酯水解还可以催化合成酯和转酯反应。幼龄畜禽内源脂肪酶分泌不足是制约其利用饲粮中脂肪的主要原因，添加外源脂肪酶可以将外源脂肪消化分解为游离脂肪酸、甘油和甘油单酯后才能被动物所利用，提高饲粮中脂肪能量的利用率。

研究表明，断奶仔猪日粮中添加脂肪酶在一定程度上可改善生产性能，提高饲料报酬[1-3]，生长肥育猪饲粮中添加脂肪酶在提高干物质和能量的真消化率，在提高有机物、粗蛋白、灰分的表观消化率方面也有一定的效果[4-5]。添加不同全脂米糠的肉鸡日粮中添加脂肪酶能提高11～14 d肉仔鸡的生长性能和全脂米糠的表观代谢能[6]，但不同来源的脂肪酶效果差异也很大。

在实际应用中，由于受饲料制粒过程中高温、高湿和挤压的影响，且动物消化道环境的pH值在不同部位差异很大，这对脂肪酶的耐稳定性和耐酸碱性提出了要求和挑战。为此，本研究选用实际生产中不同来源的脂肪酶产品，对其在不同温度和pH值处理下酶活变化的情况进行了对比评定，为脂肪酶在畜牧业中的应用提供试验指导，也为饲料企业选择合适的脂肪酶提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器及试剂

精密pH计（0.01）、恒温水浴箱、磁悬振荡器、高速匀浆机、电子天平、电冰箱、秒表、碱式滴定管；试剂若无特殊说明，均为分析纯，所用溶剂和水无注明时均为蒸馏水。

1.1.2 试验用酶

三种不同来源的脂肪酶样品由上海欧耐施生物技术有限公司实验室提供，分别标示为脂肪酶A、B、C，其酶活分别为10 000、10 000、100 000 U/g（按照以下测定方法的实测值为准）。

1.2 方法

1.2.1 脂肪酶活力的测定

① 酶活定义：1 g固体酶粉（或1 ml液体酶），在一定温度和pH值条件下，1 min水解底物产生1 μmol可滴定的脂肪酸，即为一个酶活力单位，以U/g（U/ml）表示。

② 底物配置：称取聚乙烯醇（PVA）40 g（精确至0.1 g），加水800 ml，在沸水浴中加热，搅拌，直至全部溶解，冷却后定容至1 000 ml，用干净的双层纱布过滤，取滤液备用；量取上述滤液150 ml，加橄榄油50 ml，用高速匀浆机处理6 min（分6次处理，间隔1 min，每次处理1 min），即得乳白色PVA乳化油，该溶液现用现配。

③pH值7.5的磷酸缓冲液：分别称取磷酸二氢钾1.96 g和十二水磷酸氢二钠39.62 g，用水溶解并定容至500 ml。

④0.05 mol/l氢氧化钠标准溶液：根据GB/T 601配制与标定。使用时，准确稀释10倍。

⑤酶活的测定：取两个100 ml三角瓶，分别于空白瓶A和样品瓶B中各加入底物溶液4 ml和磷酸缓冲液5 ml，再于A瓶中加入95%乙醇15 ml，于40℃水浴中预热5 min，然后于A、B瓶中各加待测酶液1 ml，立即混匀计时，准确反应15 min后，于B瓶中补加95%乙醇15 ml，终止反应，取出。再于A、B瓶中各加酚酞指示剂两滴，用氢氧化钠标准溶液滴定，直至微红色并保持30 s不褪色为滴定终点，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。

X—样品的酶活力（U/g）；

V1—滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液的体积（ml）；

V2—滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液的体积（ml）；

c—氢氧化钠标准溶液浓度（mol/l）；

50—0.05 mol/l氢氧化钠溶液1 ml相当于脂肪酸50 μmol；

n1—样品的稀释倍数；

0.05—氢氧化钠标准溶液换算系数；

1/15—反应时间15 min，以1 min计。

1.2.2 不同条件处理对脂肪酶酶活的影响

1.2.2.1 温度对脂肪酶酶活的影响

准确称取1.000 0 g脂肪酶样品，用酶保护液（5 ml甘油/100 ml，pH值7.5磷酸缓冲液）定容到100 ml，磁力常温搅拌30 min，离心取上清液待用。

将盛有9 ml保护液的试管分别置于40、50、60℃和80℃的水浴锅中预热5 min，然后分别加入1 ml酶上清液迅速摇匀并准确计时5 min，迅速取出于冰水浴中冷却，冷却后进一步稀释酶活。然后按照标准方法测定脂肪酶酶活，注意对不同温度处理的酶样分别设置空白对照组。

1.2.2.2 pH值对脂肪酶酶活的影响

配制0.1 mol/l的柠檬酸溶液，0.5 mol/l的氢氧化钠溶液备用。

配制A：0.05 mol/l的柠檬酸溶液，B：0.1 mol/l的磷酸氢二钠溶液，将A、B两种溶液按照一定比例融合，并用A或者B溶液调整pH值至3.0、4.0、5.0和6.0的缓冲液。

准确称取2.000 0 g酶样品，溶于50 ml的蒸馏水中，磁力常温搅拌30 min，静置一段时间，分别量取9 ml不同pH值的缓冲液，于37℃水域中预热10 min，然后加入1 ml酶上清液摇匀，继续在37℃水浴中静置2 h，迅速取出，用pH值7.5的缓冲液继续稀释，然后按照标准方法测定脂肪酶酶活，对不同pH值处理的酶样分别设置空白对照组。

2 结果

2.1 不同温度处理对脂肪酶酶活的影响

不同温度对脂肪酶酶活的影响结果见表1。由表1可知，脂肪酶A、B、C三者的最适温度为40℃，随着处理温度的升高，三者酶活逐渐降低，酶活损失率也越多，当温度达到80℃时，酶A损失率到达50%以上，酶C损失率为80%以上，而脂肪酶B仅为18.12%，且得知在不同的温度处理下三者相对酶活大小均为：B＞A＞C，B的稳定性较好，当温度达到80℃时，相对酶活保持在80%以上（见图1）。

表1 不同温度处理对脂肪酶酶活的影响

图1 不同温度处理对脂肪酶相对酶活的影响

2.2 不同pH值处理对脂肪酶酶活的影响

不同pH值处理对脂肪酶酶活的影响见表2。由表2可知，脂肪酶A、B和C的最适pH值为7.5，随着pH值的降低，三者酶活逐渐降低，当pH值在3.0～4.0时，A、B酶活损失率达50%以上，C酶活几乎消失，因此，在pH值由7.5降低到3.0时，A、B和C酶活的稳定性变化较大，其中C酶稳定性最差，A次之，B略好（见图2）。

3 讨论

3.1 温度对脂肪酶酶活的影响

表2 不同pH值处理对脂肪酶酶活的影响

图2 不同pH值处理对脂肪酶相对酶活的影响

目前酶的耐温性能一直是饲料用酶关注的热点问题，在饲料制粒、膨化过程中温度可达70℃以上，在伴有高温高压的条件下，大多数酶制剂等热敏性成分会因加工造成大量损失[7]，因此温度对饲用酶制剂的活性造成的影响需要加以评估。随着对脂肪酶研究的深入，其稳定性和活性就成为当今酶制剂领域需要关注的问题，研究表明，大多数脂肪酶最适作用温度为38～45℃。

由于饲料在制粒过程中物料的水分含量在15%～18%之间，因此有人认为酶在液体状态下的失活并不等于在饲料加工条件下也能失去相应的活力。周响艳等模拟饲料制粒过程中调制器内物料的水分含量，调整酶的水分为16%的情况下，对木聚糖酶进行高温处理，发现酶活损失较小，而在极端的液体状态下进行高温处理后酶活损失很大[8]，与以上说法一致。本研究中选用三种来自不同厂家的脂肪酶A、B和C，在液体状态下用不同的温度进行处理5 min后测定其酶活，结果发现，同一种脂肪酶在不同温度和不同的脂肪酶在同一种温度下，其酶活损失差异都比较大，当处理温度由50℃升高到80℃时，脂肪酶B的酶活损失率由6%增加至18%，而A由20%增加至50%，C由70%增至80%；在80℃处理后，B的酶活保留率为80%，而A保留率不足50%，C不足20%，但这是否意味着在饲料加工状态下也能失去相应的活力，有待进一步深入探讨。

3.2 pH值对脂肪酶酶活的影响

饲料中脂肪酶必须要经过胃肠道的酸性条件及内源酶的水解达到作用位点，并在作用位点的pH值范围内具有较高的活性，因此，饲料用酶需要重点考虑酶的耐酸碱功能。pH值主要通过改变酶蛋白的三维构象而影响酶活。脂肪酶的活力受pH值影响很大，pH值的变化可影响酶活性中心部位活性集团的解离，从而影响酶与底物的结合或催化底物转变为产物[7]。本研究结果表明，当pH值由7.5降至3.0时，处理2 h后脂肪酶A、B和C酶活损失均很大，当pH值处理值为3.0时，酶A和B的酶活损失率均达70%，酶C的酶活几乎消失。

4 结语

脂肪酶的稳定性是评定其产品质量的最关键因素。在实际生产应用中，影响脂肪酶稳定性的因素很多，本文就不同温度和pH值处理条件对脂肪酶酶活的影响进行了探讨，对不同来源的脂肪酶耐温性和耐酸性作了初步的对比评价，发现不同来源的脂肪酶稳定性存在较大差异，因此选择适合饲料各种加工生产条件和动物消化道环境的酶是最关键的，有待通过动物饲养试验作进一步验证。另外，在实际生产中，还需要考虑充分评估脂肪酶的潜在营养价值。