半滑舌鳎肠黏液非特异免疫相关酶对黄芪多糖的免疫应答

■ 刘金海 陈 恒 罗小丽 管 健 黄 辉

（1.集美大学水产学院，福建厦门 361021；2.集美大学水生生物技术研究所，福建厦门 361021；3.农业部东海海水健康养殖重点实验室，福建厦门 361021）

半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）属鲽形目舌鳎科舌鳎属，俗称“龙脷”、牛舌头、鳎目、鳎板、鰙鳎、细鳞、鳎米等，为名贵暖温性底栖大型海水鱼类，主要分布于我国的渤海、黄海海域。半滑舌鳎生长快、经济价值高，是理想的人工养殖种类。近年来，半滑舌鳎养殖技术方面的报道较多，而中草药及其多糖提取物作为一种新型绿色免疫增强剂也逐渐成为研究热点。黄芪多糖(APS)是从黄芪根部分离出的多糖组分，具有广泛的免疫增强和抗病毒作用，其来源丰富，作为一种新型的免疫增强剂，在畜禽中得到了广泛的应用，但在水产养殖中的应用还较少。本试验以半滑舌鳎为研究对象，通过在其基础饵料中分别添加6个不同水平的APS，检测分析其肠黏液中LSZ、POD、AKP和ACP的活性，来探讨半滑舌鳎肠黏液非特异免疫相关酶对不同剂量及不同作用时间的APS的免疫应答，为APS在半滑舌鳎养殖中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验用鱼

半滑舌鳎活鱼[（5.8±1.5）g]购买于福建省东山县“祥源汇水产养殖有限公司”，试验用鱼分为7组，即1个对照组和6个试验组。每个试验组设3个重复，每重复投放15尾半滑舌鳎鱼。

1.2 试验药品

APS（大连容海生物科技有限公司）、溶壁微球菌（中科院微生物研究所）、过氧化物酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所）、氯化钠、琼脂、牛肉膏、蛋白胨、肝素钠（国药集团化学试剂有限公司）等。

1.3 试验设备与用具

医用型净化工作台（SW-CJ-ZFD）、紫外-可见分光光度计（UV-9600）、恒温培养箱（SPX-100B-Z）、数显式恒温水浴锅（HH·S21-6S）、离心机（80-3）、混匀机（QL-811）、烘干箱（DHG-9070A）和高压灭菌锅（YXQ-LS-50 SII）等。

1.4 试验方法

1.4.1 试验用鱼养殖管理

采用单因素6水平3重复的方法，第1组为对照组，饲喂常规饵料，第2～6组饲喂试验饵料。半滑舌鳎暂养期间投喂基础(常规)饵料，试验开始后，对照组投喂常规饵料，试验组投喂试验饵料。每天于傍晚6：00和夜间10：00投喂饵料两次，1 h后吸掉残饵。试验开始时测定半滑舌鳎肠黏液LSZ、POD、AKP和ACP等酶活性底值，随后每隔18 d检测1次，共测6次，试验周期为90 d。

1.4.2 常规饵料的配制

按照常规饵料配方（见表1），先将鱼粉、沙蚕粉、豆粉、淀粉、矿物盐、酵母粉和预混料等粉状成分按所需用量混合均匀，再将搅碎的牡蛎肉、鱼油与粉状料混匀，最后制粒备用。

1.4.3 试验饵料的配制

杭州画院现任执行院长张子翔说：“打造美术重镇，弘扬先进文化，配合中心工作，服务社会公益。在当下中国画院整体的发展态势中，杭州画院负载着人们对杭州文化发展的期待。”

依据试验饵料配方（见表2），制作试验饵料。用粉碎机将常规饵料制成粉状，然后与黄芪多糖与面粉混匀，之后将血红虫、鸡蛋和水用豆浆机打碎混匀，最后将上述粉料和液料混合均匀，至饵料用手揉起可成团状且不散为宜。用制粒机将调和好的试验饵料制成2号颗粒，于烘箱中40℃烘干备用。

表1 常规饵料配方

1.4.4 培养基的配制

使用002营养肉汁琼脂培养基，把3.0 g蛋白胨、0.9 g牛肉膏、1.5 g NaCl、0.3 L蒸馏水放入500 ml锥形瓶中，然后加热到完全溶解，用NaOH调整pH值至7.0，最后放入高压蒸汽灭菌锅中，121℃灭菌20 min。灭完后，把培养基取出，等温度下降到大约60℃时，分别倒斜面和平板上。

1.4.5 微生物的培养

把1.0634溶壁微球菌冻干粉从冰箱中取出并消毒。敲下安瓿管顶部，用移液枪吸取0.3～0.5 ml适宜的液体培养基滴入安瓿管中，轻轻振荡，使冻干菌体溶解成悬浊液，吸取全部菌体悬浊液，接种于3支试管斜面培养基上，放入28℃恒温培养箱中培养。再以活化细菌为菌种，进行扩大培养，以后每3 d重新接种一次，确保菌种处于增长期状态，试验前24 h，再培养试用菌。

表2 试验饵料成分（每100 g含量）

1.4.6 肠黏液LSZ活性的测定

用移液枪分别取100 μl肠黏液和100 μl肝素钠加入于1.5 ml离心管中混匀，3 000 r/min、离心10 min，将培养24 h的溶壁微球菌用生理盐水（0.85%）配制成菌悬液（OD570=0.05），取4 ml该菌悬液与100 μl的样本上清液，于试管中混合混匀，取一半测Abs(A1)，另一半于培养箱中37℃保温30 min，取出后立即进行10 min冰浴，终止反应，均匀后测Abs（A0）。

1.4.7 过氧化物酶（POD）活性、碱性磷酸酶（AKP）活性和酸性磷酸酶（ACP）活性的测定

POD、AKP和ACP的活性均使用由南京建成生物技术研究所生产的试剂盒进行测定。

1.5 数据处理

采用Excel和SPSS 17.0软件进行数据处理和统计分析。

2 结果

2.1 APS对半滑舌鳎肠黏液溶菌酶活性的影响（见表3）

表3 半滑舌鳎肠黏液溶菌酶（LSZ）活性（IU，X±SE）

由表3可知，各试验组半滑舌鳎肠黏液LSZ活性随试验时间延长基本呈先增后减的变化趋势，18 d后，各试验组半滑舌鳎肠黏液LSZ活性均极显著高于对照组（P＜0.01），试验中半滑舌鳎肠黏液LSZ活性随APS添加剂量增高，而较早达到较高水平，之后便出现下降趋势。试验结束时，各试验组半滑舌鳎肠黏液LSZ活性均极显著高于对照组（P＜0.01），其中尤以第2、3组作用效果最好。

2.2 APS对半滑舌鳎肠黏液过氧化物酶活性的影响（见表4）

表4 半滑舌鳎肠黏液过氧化物酶（POD）活性（IU，X±SE）

由表4可知，在同剂量APS作用下，第1、2组半滑舌鳎肠黏液POD活性随时间延长呈逐步增强的变化趋势，第3、4组呈先降后增的变化趋势，第5、6组呈先增后减的变化趋势，其中，第2组在18 d后极显著高于对照组(P＜0.01)，第5、6组则于36 d后极显著高于对照组(P＜0.01)，第1组则于54 d后极显著高于对照组(P＜0.01)；试验中半滑舌鳎肠黏液POD活性随APS添加剂量增高而较早达到较高水平，之后便持续下降。试验结束时，各试验组半滑舌鳎肠黏液POD活性均极显著高于对照组(P＜0.01)，其中尤以第1、2组作用效果最好。

2.3 APS对半滑舌鳎肠黏液碱性磷酸酶活性的影响（见表5）

表5 半滑舌鳎肠黏液碱性磷酸酶（AKP）活性（IU，X±SE）

由表5可知，第2、3、4组半滑舌鳎肠黏液AKP活性随时间延长均呈先增后减的变化趋势，第1组呈先降后增的变化趋势，第5、6组呈先降后增之后再次降低的变化趋势；半滑舌鳎肠黏液AKP活性随APS添加剂量增高，而较早达到较高水平，之后便逐渐下降。试验结束时，第2、3、4、5组半滑舌鳎肠黏液AKP活性均极显著高于对照组（P＜0.01），其中尤以第2、3组作用效果较好。第1、6两组半滑舌鳎肠黏液AKP活性与对照组相比较无显著差异（P＞0.05）。

2.4 APS对半滑舌鳎肠黏液酸性磷酸酶活性的影响（见表6）

表6 半滑舌鳎肠黏液酸性磷酸酶（ACP）活性（IU，X±SE）

试验中，第1、2组半滑舌鳎肠黏液ACP活性随时间延长呈逐步增强的变化趋势，18 d后极显著高于对照组（P＜0.01）；其余各组半滑舌鳎肠黏液ACP活性则随时间延长呈先增后减的变化趋势，试验中半滑舌鳎肠黏液ACP活性随APS添加剂量增高而较早达到较高水平，随后逐渐下降。试验结束时，各试验组半滑舌鳎肠黏液ACP活性均极显著高于对照组（P＜0.01）；其中尤以第2组作用效果较好。

3 讨论

3.1 APS对半滑舌鳎肠黏液LSZ活性的影响

溶菌酶（LSZ）是吞噬细胞杀菌的物质基础，它是动物机体许多组织重要的非特异性免疫因子。在动物免疫研究中，LSZ活性是衡量动物体非特异性免疫力的一个重要量化指标。袁吕江等发现，鱼腥草素同系物能够提高小鼠血清溶菌酶活性，且随浓度增加增幅加大，最大可达20%。体外试验时，在低浓度时鱼腥草素同系物明显提高溶菌酶的活性，超过一定浓度时则表现出抑制溶菌酶的活性。本研究发现，半滑舌鳎肠黏液中LSZ活性，各试验组基本呈先增后降的变化趋势，且中低剂量APS可较大程度提高LSZ活力。这与袁吕江研究的小鼠LSZ的活力随鱼腥草同系物浓度低促高抑的结论基本一致。

3.2 APS对半滑舌鳎肠黏液POD活性的影响

过氧化物酶（POD）普遍存在于真核生物的各类细胞中，尤其是在肝细胞和肾细胞中数量特别多。研究发现，POD活性与生物的非特异免疫功能水平有一定程度的关联。顾华杰等为探究灰树花多糖对吉富罗非鱼免疫细胞和抗氧化酶活性的影响，在饲料中分别添加质量分数为0、0.05%、0.20%灰树花多糖，结果表明，灰树花多糖对吉富罗非鱼血清、肝脏中过氧化物酶活性有显著促进作用，且表现出明显的剂量效应，且过氧化氢酶活性受多糖的促进作用随时间延长逐渐减弱。本研究发现，低剂量的APS（300 mg/kg≤APS≤600 mg/kg）对半滑舌鳎肠黏液POD活性具有逐渐增强作用，中剂量的APS（900 mg/kg≤APS≤1 200 mg/kg）具有先抑后促的作用，高剂量的APS（1 500 mg/kg≤APS≤1 800 mg/kg）具有先抑后促随后再次抑制的作用；54 d后，所有试验组黏液POD活性极显著高于对照组(P＜0.01)，且低剂量组（300 mg/kg≤APS≤600 mg/kg）效果较好；高剂量的APS（1 500 mg/kg≤APS≤1 800 mg/kg）对半滑舌鳎肠黏液POD活性的提高在54 d时达到最强，其后逐渐下降，这与顾华杰等研究结果基本一致。但由于两试验中饲料所添加的物质和剂量均不同，故两试验中的POD活性对各自物质的免疫应答程度也有所不同。

3.3 APS对半滑舌鳎肠黏液AKP活性的影响

碱性磷酸酶（AKP）是广泛分布于人体及动物体的肝脏、骨骼、肠、肾等组织经肝脏向胆外排出的一种酶。这种酶能催化核酸分子脱掉5'磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5'-P末端转换成5'-OH末端。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。张桐等为观察饲料中添加不同水平的维生素D3对松浦镜鲤幼鱼体成分、血清钙磷和碱性磷酸酶活性的影响，分别投喂维生素D3添加量为0、200、400、800、1 600、3 200 IU/kg及1×105IU/kg的7种饲料，试验时间为56 d，结果表明，随着维生素D3添加量的增加，全鱼钙磷含量、血清钙磷离子浓度和碱性磷酸酶活性均有先升高后降低的趋势，且当饲料中维生素D3添加量达到800 IU/kg时血清中的碱性磷酸酶活性最高。本研究发现，第2、3、4组半滑舌鳎肠黏液AKP活性随时间延长均呈先增后减的变化趋势，第1组呈先降后增的变化趋势，第5、6组呈先降后增之后再次降低的变化趋势；试验中随APS添加剂量增高，半滑舌鳎肠黏液AKP活性达到较高水平时间也较早，之后便逐渐下降。低剂量APS组（300 mg/kg≤APS≤600 mg/kg）半滑舌鳎肠黏液AKP活性至72 d时达最大值，中高剂量APS组（900 mg/kg≤APS≤1 800 mg/kg）半滑舌鳎肠黏液AKP活性则至36 d时达最大值，随后均呈下降趋势。本研究与张桐等的研究结果基本一致，但AKP活性达最高值时添加物的量有所不同，这可能是两试验的研究对象不同所致。

3.4 APS对半滑舌鳎肠黏液ACP活性的影响

酸性磷酸酶（ACP）主要存在于动物体的巨噬细胞，定位于溶酶体内。酸性磷酸酶是一种在酸性条件下催化磷酸单酯水解生成无机磷酸的水解酶。国内外在对水产动物ACP的理化性质、结构功能及催化机理方面作了大量的研究工作。牟海津等采用1.0%的虫草多糖或海藻多糖作为免疫药物，对栉孔扇贝进行注射刺激后，发现血清中的ACP活性有显著提高，血细胞中的ACP活性也有所增加，而肝脏提取液中该酶活性的变化不很明显。本研究发现，低剂量APS（300 mg/kg≤APS≤600 mg/kg）作用下，半滑舌鳎肠黏液ACP活性随时间延长呈逐步增强的变化趋势；随APS添加剂量的增加，中高剂量（900 mg/kg≤APS≤1 800 mg/kg）的APS可以使半滑舌鳎肠黏液ACP活性呈先增后减的变化趋势，APS剂量越高其肠黏液ACP活性越较早达到最大值，随后越较早对其肠黏液ACP活性的提高产生抑制作用，这与牟海津等的研究结果有所不同，可能是由于研究对象、组织以及作用时间不同所致。

4 小结

① APS对半滑舌鳎肠黏液LSZ、POD、AKP、ACP四种酶的活性具有显著的影响，低剂量的APS对其具有增强的作用，高剂量的APS对其具有先增强后抑制的作用。

② 半滑舌鳎肠黏液中LSZ、POD、AKP、ACP四种酶活性对APS的应答时序有所不同，第36 d时，900 mg/kg组半滑舌鳎肠黏液AKP活性对APS的应答达到最强，之后便逐渐降低；54 d时，900 mg/kg组半滑舌鳎肠黏液LSZ活性、900 mg/kg组和1 200 mg/kg组ACP活性对APS的应答达到最强，之后便逐渐降低；至90 d时，300 mg/kg组和600 mg/kg组半滑舌鳎肠黏液中POD活性对APS的应答才最终达到最强。

③从节约饵料成本及提高半滑舌鳎肠黏液免疫活性的角度出发，建议在饵料中添加APS的较佳剂量为600 mg/kg。

（参考文献18篇，刊略，需者可函索）